Chiết xuất gỗ Kiam
Gỗ Kiam, được thu hoạch từ một vườn cây ở tỉnh Phatthalung, Thái Lan, được cắt thành từng mảnh và sau đó sấy trong lò ở nhiệt độ 50 °C trong 18 giờ. Các mảnh gỗ đã sấy khô được xay bằng máy xay nhuyễn và tiếp tục xử lý bằng máy trộn AY46 để đạt được kích thước hạt nhỏ hơn 80 mesh. Vật liệu bột này sau đó được đồng nhất hóa trong ethanol với các nồng độ khác nhau (0, 60, 70, 80 và 99.60%), sử dụng tỷ lệ bột: dung môi là 1:15 ở 10.000 vòng/phút trong 2 phút. Mỗi hỗn hợp đồng nhất được khuấy trong suốt đêm ở nhiệt độ phòng và lọc qua giấy lọc Whatman No. 1. Các dịch lọc được cô đặc ở 40 °C bằng cách sử dụng máy bay hơi quay. Để loại bỏ bất kỳ ethanol còn lại, các chiết xuất được thổi với khí nitơ trong 10 phút và sau đó được đông khô trong 3 ngày. Các chiết xuất khô được xay nhuyễn thêm bằng cối, đóng gói trong túi zip-lock và lưu trữ trong bình hút ẩm để phục vụ cho phân tích sau này.
Xác định hoạt động kháng khuẩn
Chuẩn bị mầm bệnh
Hoạt động kháng khuẩn của Chiết xuất Gỗ Kiam (KWE) được đánh giá chống lại Vibrio parahaemolyticus ATCC17802. Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ Khoa Công nghiệp Nông nghiệp tại Đại học Prince of Songkla. Mỗi chủng được nuôi trong môi trường Tryptic Soya Broth (TSB, CM0129 OXOID) bổ sung 3% natri clorua (KA465, KEMAUS) và được ấp ở 37 °C trong 24 giờ. Sau khi ấp, mật độ tế bào được chuẩn hóa để phù hợp với tiêu chuẩn độ đục 0.5 McFarland, tương đương với khoảng 1.5 × 108CFU/mL40.
Thử nghiệm khuếch tán đĩa
Bột KWE được hòa tan trong 2% dimethyl sulfoxide (DMSO, D5879 SIGMA ALDRICH) để đạt được nồng độ cuối cùng là 500 mg/mL. Dung dịch sau đó được tiệt trùng bằng cách lọc qua bộ lọc syringe 0.22 μm (SARTORIUS, Minisart). Mười microlit của dung dịch này được pipet lên một đĩa giấy tiệt trùng 6 mm, tạo ra nồng độ 5 mg KWE mỗi đĩa. Các đĩa giấy đã ngấm KWE được sấy khô trong không khí trong 15 phút và lưu trữ ở 4 °C cho đến khi cần. Để kiểm tra các tính chất kháng khuẩn, phương pháp khuếch tán đĩa được mô tả bởi Ngamsurach và Praipipat41 được sử dụng chống lại mầm bệnh mục tiêu (V. parahaemolyticus ATCC17802). Mầm vi khuẩn, đã được điều chỉnh theo tiêu chuẩn 0.5 McFarland, được cấy lên môi trường agar Mueller-Hinton (MHA, M391, HiMedia) bằng tăm bông tiệt trùng. Các đĩa giấy đã ngấm KWE được đặt lên các đĩa vi khuẩn theo dạng đôi và ấp ở 37 °C trong 18 giờ. Làm đối chứng, 10 µL DMSO 2% được sử dụng làm đối chứng âm, trong khi potassium sorbate với 5 mg mỗi đĩa được dùng làm đối chứng dương. Sau 18 giờ ấp, đường kính của các vùng ức chế được đo bằng thước cặp Vernier (Series 530, Mitutoyo, Nhật Bản).
Đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được đánh giá bằng kỹ thuật pha loãng vi mô nối tiếp với các pha loãng gấp đôi, dựa trên phương pháp của Sallau, et al.42, có một số điều chỉnh. KWE được pha loãng nối tiếp trong môi trường Mueller-Hinton (MHB, M391, HiMedia) chứa 3% NaCl, sử dụng các đĩa 96 giếng để đạt được mười nồng độ khác nhau trong thể tích 50 µL. Mỗi nồng độ được kiểm tra ba lần. Dung dịch vi khuẩn được điều chỉnh theo tiêu chuẩn 0.5 McFarland bằng dung dịch NaCl 0.85% và sau đó pha loãng với MHB để đạt khoảng 1.5 × 105 CFU/mL. Mỗi giếng được cấy với 50 µL dung dịch vi khuẩn này. Các nồng độ cuối cùng của KWE dao động từ 4 đến 4096 µg/mL. Potassium sorbate với cùng nồng độ như KWE được sử dụng làm đối chứng dương. Sau khi ấp các đĩa ở 37 °C trong 15 giờ, 20 µL dung dịch resazurin 0.09% (w/v) được thêm vào mỗi giếng, tiếp theo là 3 giờ ấp bổ sung. MIC được xác định bằng cách quan sát trực quan các giếng có sự thay đổi màu từ xanh sang hồng; nồng độ KWE thấp nhất không có sự thay đổi màu được ghi nhận là giá trị MIC. Để xác định MBC, 10 µL dung dịch từ những giếng không có sự thay đổi màu được nuôi cấy trên môi trường agar Mueller-Hinton (MHA, M391-HiMedia), và các đĩa được ấp ở 37 °C trong 24 giờ. MBC được định nghĩa là nồng độ KWE thấp nhất không tạo ra sự phát triển vi khuẩn trên MHA sau khi ấp.
Ức chế sự hình thành biofilm
KWE với hoạt động kháng khuẩn cao nhất được chọn để kiểm tra khả năng ức chế sự hình thành biofilm. Khả năng của KWE để ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây hư hỏng và vi khuẩn gây bệnh được thực hiện theo một giao thức của Lopes, et al.43 với một số điều chỉnh nhẹ. Tóm lại, V. parahaemolyticus ATCC17802 được nuôi cấy trong TSB bao gồm 3% NaCl và được sử dụng với sự ấp ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đó, nồng độ tế bào được điều chỉnh thành tiêu chuẩn 0.5 MacFarland với dung dịch NaCl 0.85% và sau đó pha loãng với TSB hoặc TSB có môi trường 3% NaCl để đạt được khoảng 1.5 × 105 CFU/mL. Mầm bệnh (100 µL) được thêm vào một đĩa phẳng đáy 96 giếng và trộn với KWE ở 4MIC, 2MIC, MIC và 1/2MIC, sau đó được ấp ở 37 oC trong 48 giờ. Sau đó, các tế bào váng và môi trường được loại bỏ, rửa bằng dung dịch đệm phosphate (PBS; pH 7.4) ba lần, và làm khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, 200 µL dung dịch tinh thể tím 0.1% (w/v) được thêm vào mỗi giếng, tiếp theo là ấp ở nhiệt độ phòng (~ 25 oC) trong 45 phút. Sau đó, tinh thể tím (CV) được bỏ đi, rửa với PBS ba lần, và làm khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. CV được hòa tan bằng cách sử dụng 200 µL ethanol 95% trong 10 phút và độ hấp thụ được đo ở 570 nm. Sự ức chế hình thành biofilm (IBF) được tính toán theo phương trình dưới đây.
$$\:IBF=\:\frac{{(C}_{+}-\:C\_)-(AbsT-\:C\_)\:}{{(C}_{+}-\:C\_)}\times100$$
C+ là OD570 của biofilm nhuộm CV không có chiết xuất; C− là OD570 của biofilm nhuộm CV không có vi khuẩn; AbsT là OD570 của biofilm nhuộm CV có chiết xuất.
Thử nghiệm chống di động
Khả năng di chuyển và di cư được thử nghiệm bằng phương pháp được mô tả bởi Buatong, et al.44, với một số điều chỉnh nhỏ. Một mẫu 2 µL của văn hóa V. parahaemolyticus ATCC17802 được cấy vào giữa môi trường agar mềm (0.5% agar, 30 g/L TSB) và agar mềm bơi (0.2% agar, 30 g/L TSB), cả hai đều chứa 5 g/L NaCl. Các agar này được bổ sung KWE ở các nồng độ 2MIC, MIC, 1/2MIC, 1/4MIC và 1/8MIC. Potassium sorbate với cùng nồng độ được sử dụng làm đối chứng. Sau khi ấp ở 37 °C, đường kính của các thuộc địa được đo ở 2, 4, 6, 8 và 10 giờ cho khả năng di chuyển và ở 8, 12 và 24 giờ cho khả năng di cư.
Kính hiển vi điện tử quét
Hình dạng tế bào của vi khuẩn chưa điều trị và đã điều trị KWE được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét, theo giao thức mô tả bởi Sinlapapanya, et al.45. V. parahaemolyticus ATCC17802 được xử lý bằng KWE với nồng độ 4MIC. Potassium sorbate với cùng nồng độ (4MIC) được sử dụng làm đối chứng dương. Các tế bào vi khuẩn được nuôi trong môi trường nuôi cấy một mình đóng vai trò làm đối chứng âm.
Xác định các hợp chất phenolic
Các hợp chất trong KWE được xác định bằng cách sử dụng Máy quang phổ khối khối Quadrupole (Agilent 1290 Infinity LC-6540, Agilent Technologies, Waldbronn, Đức). Hệ thống được trang bị Bộ phát hiện Diode Array (DAD), một cột Agilent Poroshell 120 EC-C18 (4.6 × 150 mm, 2.7 μm), một bộ tự động mẫu và một bơm hai chiều. Ngăn cột được đặt ở 35 °C cho sự tách sắc ký. Bộ tự động mẫu bơm 1 µL mẫu, với tốc độ dòng 0.2 mL/phút và áp suất tối đa 1,000 bar. Phase di động gồm nước với 0.1% axit formic (dung môi A) và acetonitrile với 0.1% axit formic (dung môi B) theo tỷ lệ 95:5. Phân tích khối được thực hiện bằng cách sử dụng các nguồn ion ESI kép với phạm vi 100–1000 m/z. Các cài đặt thiết bị bao gồm điện áp capillary 3500 V, nhiệt độ khí 300 °C với dòng 11 L/phút, điện áp mảnh 135 V, điện áp skimmer 65 V, áp suất khí phun 45 psi, và đỉnh RF Octopole 750 V. Cả quét ở chế độ dương và âm đều được thực hiện. Xử lý dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng phần mềm Personal Compound Database and Library (PCDL) và Agilent Mass Hunter Workstation (Analisis định tính, phiên bản B.08.00). Khối lượng và công thức phân tử của các đỉnh được chọn được xác định bằng cách sử dụng hệ thống công cụ LC-MS và hệ thống nguồn điện cực phun (ESI), cung cấp thông tin khối chính xác từ các ion mẹ và các mảnh vỡ phân hủy do nguồn gây ra.
Đánh giá hiệu quả của Chiết xuất Gỗ Kiam trong việc điều trị tôm bị nhiễm V. parahaemolyticus
Thức ăn bổ sung KWE được chuẩn bị bằng cách đồng đều trộn chiết xuất vào các viên thức ăn tôm thương mại, theo phương pháp được mô tả bởi Dewi, et al.46, với một số điều chỉnh nhẹ. Tóm lại, 51.2 mg KWE (MBC) được trộn với 20 mg phụ gia thức ăn (progol), và hòa tan trong 25 mL nước cất để đảm bảo phân bố đồng đều. Dung dịch này sau đó được phun đều lên 100 mg viên thức ăn. Đối với thức ăn đối chứng, cùng một lượng nước cất và phụ gia được sử dụng mà không có KWE. Thức ăn bổ sung KWE được làm khô bằng không khí ở nhiệt độ phòng để loại bỏ độ ẩm thừa trong khi vẫn bảo tồn các hợp chất sinh học trong KWE. Khi khô, thức ăn được đặt vào các container kín và lưu trữ ở 4 °C để duy trì sự ổn định và hiệu quả trong suốt thời gian thử nghiệm cho ăn.
Tổng cộng 500 con tôm trắng Thái Bình Dương (Penaeus vannamei), nặng 0.8 g và dài 54 mm, được lấy từ PT. Windu Raya Hatchery ở Situbondo, Đông Java, Indonesia. Tôm được vận chuyển trong túi nhựa có khí để hỗ trợ đến Phòng thí nghiệm Nuôi trồng Thủy sản tại Khoa Thủy sản và Biển, Đại học Airlangga. Tại phòng thí nghiệm, tôm được làm quen ban đầu trong bể sợi 500 L với mật độ nuôi 1 tôm mỗi lít trong 5 ngày. Chúng được cho ăn 5% trọng lượng cơ thể mỗi ngày, chia thành ba bữa. Sau thời gian làm quen, tôm được nhịn ăn trong 24 giờ và sau đó được chuyển đến các bể thí nghiệm với mật độ 1 tôm mỗi lít vào ngày 0. Chúng sau đó được chia thành ba nhóm điều trị:
T1: Đối chứng âm nơi mà tôm được cho ăn với chế độ ăn bình thường không có nhiễm khuẩn.
T2: Đối chứng dương nơi mà tôm được nhiễm trước với V. parahaemolyticus ở nồng độ cuối cùng 1.5 × 104 CFU/gr và được cho ăn thức ăn bình thường.
T3: Tôm bị nhiễm với V. parahaemolyticus và sau đó được cho ăn chế độ ăn đã thấm KWE với nồng độ cuối cùng 512 µg/g chế độ ăn (MBC cho V. parahaemolyticus).
Nhiễm khuẩn được kích thích bằng cách cho tôm ăn chế độ ăn chứa V. parahaemolyticus ở nồng độ cuối cùng 1.5 × 104 CFU/g trong 2 ngày. Nhiễm khuẩn được theo dõi thông qua các triệu chứng lâm sàng như giảm ăn, gan tụy nhợt nhạt, tăng tỷ lệ tử vong, và sản xuất phân trắng. Ngày thứ ba (ngày 3), tôm ở các nhóm đối chứng âm (T1 và T2) được chuyển sang chế độ ăn cơ sở, trong khi tôm ở nhóm T3 được cho ăn chế độ ăn trộn với KWE ở nồng độ cuối cùng 512 µg/g chế độ ăn. Trong suốt thử nghiệm, tỷ lệ sống sót, phản ứng miễn dịch (bao gồm tổng số tế bào huyết học và sự phân biệt tế bào huyết học), và tổng số Vibrio trong ruột tôm được đánh giá.
Tỷ lệ sống sót (SR)
Tỷ lệ sống sót được tính bằng cách đếm số lượng tôm vào đầu giai đoạn thí nghiệm và số lượng tôm sống cuối cùng vào cuối giai đoạn thí nghiệm. Sau đó SR được tính theo công thức sau:
$$\:SR\:\left(\%\right)=\frac{number\:of\:living\:shrimps\:at\:the\:end\:of\:experimental\:period}{number\:of\:living\:shrimp\:at\:the\:begining\:of\:experimental\:period}\times100$$
Tổng số Vibrio (TVC)
TVC được thực hiện bằng cách thu thập 1 g ống tiêu hóa và trộn trong 9 ml dung dịch NSS 0.85%. Sau đó, hỗn hợp được pha loãng nối tiếp từ 10−1 − 10−6. 100 µl dung dịch từ mỗi ống pha loãng được trải lên môi trường TCBS agar theo dạng đôi và ấp ở 28 °C trong 24 giờ. Các thuộc địa vi khuẩn đã phát triển và cho thấy sự tách biệt tốt được đếm và tính toán để xác định giá trị TVC.
Tổng số tế bào huyết học (THC)
THC được đếm vào các ngày 0, 3, 6, 9, 12 và 15 của các giai đoạn nuôi cấy theo giao thức của Ekawati et al. (2012) với một số điều chỉnh nhẹ. Hai con tôm khỏe mạnh được thu thập từ mỗi bể, và huyết dịch được lấy bằng cách sử dụng một ống tiêm 1 ml đã được điền sẵn thuốc chống đông theo tỷ lệ 1:1. Một trăm µl hỗn hợp được nhỏ lên bề mặt một kính đếm tế bào và được đậy bằng một lớp kính đậy. Số lượng tế bào huyết dịch được quan sát và đếm dưới kính hiển vi hai mắt với độ phóng đại 40x. Dữ liệu thu được được ghi lại và tính toán theo công thức dưới đây:
$$\:\text{THC}=\:\frac{\sum\:\text{number of counted cells}}{\sum\:\text{Total number of cells}}\:\times\:25\:\times\:\:\frac{1}{Haemocytometer\:volume}\:\times\:\text{FP}$$
trong đó: THC là tổng số tế bào huyết học (cells/ml), và FP là hệ số pha loãng.
Đếm tế bào huyết học phân biệt (DHC)
Thử nghiệm DHC được thực hiện vào các ngày 0, 3, 6, 9, 12 và 15 của giai đoạn nuôi cấy theo giao thức của Widanarni, et al.47 với một số điều chỉnh. Tóm lại, 100 µL huyết dịch được thu thập từ tôm được nhỏ lên một kính kính, để khô không khí, và cố định bằng methanol 100% trong 10 phút. Các mẫu này được để khô không khí sau khi được cố định bằng methanol 100% và được nhuộm bằng cách ngâm trong dung dịch Giemsa 10% trong 15 phút. Các mẫu được để khô, rửa sạch bằng nước chảy trong 30 giây và để khô. Các mẫu này được quan sát bằng kính hiển vi ánh sáng với độ phóng đại 40x và được phân biệt theo loại của chúng, bao gồm tế bào hyaline, tế bào bán hạt và tế bào hạt (Abdi, 2022). Công thức tính toán DHC như sau:
$$\:\text{Haemocyte counts}\:\left(\%\right)=\frac{\text{Number of each haemocyte cell} \text{(Hialin)}}{\text{Total haemocyte}}\times\:100$$
Trong suốt thử nghiệm, các thông số chất lượng nước—bao gồm pH, nhiệt độ, oxy hòa tan (DO), và độ mặn—được theo dõi hàng ngày và duy trì ở mức tối ưu cho việc nuôi tôm trắng Thái Bình Dương. pH được giữ trong khoảng 7.5 đến 8.5, nhiệt độ ở mức 28 –33 °C, mức DO được duy trì trên 4 mg/L, và độ mặn được giữ trong khoảng 33 và 34 ppt (SNI 8037.1:2014).
Phân tích thống kê
Dữ liệu được phân tích thống kê bằng cách sử dụng phân tích phương sai (ANOVA). Bất kỳ giá trị nào khác biệt đáng kể giữa các điều trị được phân tích thêm bằng thử nghiệm đa phạm vi Tukey với giới hạn tự tin 95% (p
Nguồn : https://www.nature.com/articles/s41598-025-96013-7
