Nghiên cứu viên khám phá giải pháp cho bệnh tôm lớn
Virus hội chứng đốm trắng (WSSV) đã gây ra tổn thất kinh tế lớn cho người nuôi tôm trên toàn thế giới kể từ những năm 1990. Nhiều phương pháp điều trị và chiến lược để kiểm soát WSSV đã được thử nghiệm, cho thấy các mức độ hiệu quả khác nhau. Một số trong số đó bao gồm các tác nhân kích thích miễn dịch, việc quản lý các protein virus tái tổ hợp, điều chỉnh nhiệt độ nước, vắc-xin DNA và can thiệp RNA (RNAi).
WSSV có tới 531 gen giả thuyết, một số trong số đó có thể thiết yếu cho sự nhiễm/sao chép WSSV. Hầu hết các gen WSSV có vai trò chưa rõ trong sự nhiễm virus. Một số nghiên cứu đã sử dụng RNAi chống lại các gen WSSV, mã hóa các protein cấu trúc tham gia vào kiến trúc virion và sự xâm nhập của virus. Các nghiên cứu khác đã đánh giá hiệu quả kháng virus của các protein không cấu trúc của WSSV.
Có khả năng hiệu quả kháng virus của các phân tử RNAi phụ thuộc vào các gen mục tiêu. Việc làm im lặng các gen WSSV với vai trò thiết yếu trong sự sao chép virus có thể thể hiện hiệu ứng kháng virus mạnh mẽ hơn và giảm thiểu tỷ lệ tử vong ở tôm.
Cài đặt nghiên cứu
Tác giả do đó đã thiết lập một nghiên cứu để đánh giá hiệu quả kháng virus của RNA đôi (ds)RNA chống lại các gen không cấu trúc WSSV orf89 và wsv191 trong tôm trắng Thái Bình Dương (Litopenaeus vannamei) và so sánh nó với dsRNA chống lại các gen WSSV vp28 và vp26 trong các điều kiện thí nghiệm.
Tôm giống từ một trại giống ở Sonora, Mexico, đã được kiểm tra âm tính WSSV qua phân tích chuỗi polymerase (PCR). Các động vật đã được duy trì trong nước biển nhân tạo với độ mặn 25 g/L, nhiệt độ 27 ± 2 độ C và thông khí liên tục. Thay nước 50% được thực hiện mỗi ba ngày để duy trì chất lượng nước tốt.
Một mẫu nhiễm WSSV được chuẩn bị từ tôm bị nhiễm tự nhiên từ Sinaloa, Mexico, đã được titrat trong điều kiện sống. Đối với mỗi lần pha loãng hàng chục (10-2-10-7), năm con tôm đã được tiêm nhiễm vào cơ và được giữ riêng lẻ trong các bể 12-L chứa nước biển nhân tạo.
Các con tôm đã được theo dõi hai lần mỗi ngày để kiểm tra các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm WSSV và tỷ lệ tử vong trong 10 ngày. Khả năng lây nhiễm và tỷ lệ chết được xác định là 105.6 SID50/mL và 105.6 L.D.50/mL, tương ứng. SID50 là liều nhiễm trùng tôm dẫn đến 50 phần trăm tôm bị nhiễm. L.D.50 là liều đơn mà sẽ gây tử vong cho 50 phần trăm của một nhóm động vật kiểm tra.
RNAi chống lại bốn gen WSSV – vp26, vp28, vp191 và orf89 – được sản xuất dưới dạng dsRNA bằng cách sử dụng bộ dụng cụ phiên mã thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bảng 1 bao gồm thông tin về các mồi đặc hiệu và điều kiện PCR tiêu chuẩn được sử dụng để khuếch đại các gen.
Điều trị
Các nhóm 10 tôm L. vannamei tự do WSSV đã được định hình trong 24 giờ trong các bể 80-L chứa nước biển nhân tạo với độ mặn 25 g/L, nhiệt độ 25 ± 2 độ C và thông khí liên tục. Mỗi nhóm đã được tiêm 4 μg qua các mũi tiêm với một trong các dsRNA.
Một nhóm đã được điều trị bằng 40 µL dsRNA chống lại gen LacZ của vi khuẩn và được sử dụng như một nhóm đối chứng. Một nhóm khác gồm 10 con tôm đã được điều trị giả với 40 µL dung dịch đệm phosphate và được sử dụng làm đối chứng dương tính. Ba bản sao được thực hiện cho mỗi điều trị.
Sau 48 giờ, tất cả các động vật được điều trị đã bị thách thức bằng cách tiêm 1 liều cao (2,500 SID50 trong 50 µL) WSSV. Các con tôm được theo dõi hai lần mỗi ngày trong 10 ngày sau khi thách thức để kiểm tra các dấu hiệu lâm sàng của bệnh và tỷ lệ tử vong. Các con tôm bị bệnh nặng và chết được ghi lại và lấy mẫu mô để phát hiện WSSV.
Vào cuối thí nghiệm, những con tôm sống sót đã bị hy sinh, và mang của chúng được sử dụng để trích xuất RNA và phân tích PCR WSSV. Hiệu quả kháng virus của các dsRNA khác nhau được đánh giá dựa trên tỷ lệ tử vong tích lũy và số lượng tôm bị nhiễm WSSV.
Kết quả
Nhóm điều trị giả và tôm được điều trị bằng dsRNA LacZ đã lần đầu tiên cho thấy các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm WSSV, chẳng hạn như giảm ăn, bơi bất thường và/hoặc uể oải sau 24 giờ sau tiêm nhiễm (hpi). Những ca tử vong đầu tiên được ghi nhận vào 36 hpi. Hai nhóm này có tỷ lệ tử vong 100% vào 108 hpi (Hình 1), và tất cả các động vật trong các nhóm này đều dương tính WSSV qua PCR (Hình 2).
Tôm được điều trị bằng dsRNA vp28 đã cho thấy các ca tử vong đầu tiên vào 72 hpi và tỷ lệ tử vong tích lũy cuối cùng là 7%. Các động vật được điều trị bằng dsRNA orf89 đã hiển thị các ca tử vong đầu tiên vào 108 hpi, và tỷ lệ tử vong tích lũy của chúng vào cuối thí nghiệm là 10%. Tôm được điều trị bằng dsRNA vp26 đã chứng kiến các ca tử vong đầu tiên vào 84 hpi và tỷ lệ tử vong tích lũy là 21%. Các động vật được điều trị bằng dsRNA wsv191 đã ghi nhận các ca tử vong đầu tiên vào 24 hpi và tỷ lệ tử vong tích lũy cuối cùng là 83% (Hình 1).
Tất cả các động vật chết trong các điều trị này đều dương tính WSSV qua PCR. Các tôm sống sót không hiển thị các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm WSSV và âm tính WSSV qua kiểm tra RT-PCR (Hình 3).
Phản ứng kháng virus
Một liều dsRNA 4 µg/shrimp là đủ để kích hoạt một phản ứng kháng virus chống lại một thử thách WSSV chết người. dsRNA đặc hiệu theo trình tự đã ức chế hiệu quả sự sao chép virus và giảm thiểu tỷ lệ tử vong ở các tôm được điều trị. Vào cuối các thí nghiệm, hầu hết các động vật được điều trị bằng dsRNA chống lại các gen WSSV đã sống sót và có tỷ lệ nhiễm WSSV thấp. Ngược lại, tôm được điều trị bằng dsRNA không phụ thuộc trình tự (gen LacZ của vi khuẩn) đã bị nhiễm và chỉ trải qua sự trì hoãn về thời gian tử vong.
Tôm được điều trị bằng dsRNA chống lại vp28 và vp26 đã được bảo vệ trước thách thức WSSV rất chết người. Các gen vp28 và vp26 mã hóa các protein cấu trúc VP28 và VP26, đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc virion, sự bám dính của virus và sự nhiễm bệnh.
Hai dsRNA chống lại các gen không cấu trúc WSSV orf89 và wsv191 cho thấy rằng việc làm im lặng gen orf89 rất hiệu quả trong việc giảm sự sao chép virus và tỷ lệ tử vong của tôm theo cách tương tự như quan sát được với dsRNA vp28. Ngược lại, dsRNA chống lại wsv191 có hiệu ứng kháng virus thấp nhất trong bốn dsRNA cụ thể theo trình tự được thử nghiệm.
Triển vọng
Các chức năng của hai protein không cấu trúc được mã hóa bởi các gen WSSV này có thể giúp giải thích sự khác biệt trong hoạt động kháng virus. Gen orf89 được biểu hiện sớm trong quá trình sao chép virus và mã hóa một protein virus có chức năng điều tiết tiêu cực. Gen này có thể có vai trò thiết yếu trong quá trình nhiễm/sao chép virus, và do đó việc làm im lặng nó đã ảnh hưởng lớn đến kết quả của nhiễm WSSV. Ngược lại, gen wsv191 có thể không phải là một gen thiết yếu cho sự sao chép của WSSV, mặc dù nó có thể mã hóa một endonuclease không đặc hiệu với cả hoạt động DNAse và RNAse. Việc làm im lặng của nó không có ý nghĩa trong việc ức chế sự sao chép virus.
| Tên mồi | Chuỗi (5′ > 3′) | Kích thước sản phẩm PCR (bp) |
|---|---|---|
| orf89F1 orf89R1 | AGGACCCGATCGCTTACTTTGA CAAGAAACCGGGAGGGATTTTC | 483 |
| wsv191F1 wsv191R1 | AAGTGGGTGCGCAACAAAATA TGTAGAGGGCATGAGGGATAG | 451 |
| vp28F3 vp28R3 | ATGGATCTTTCTTTCAC TTACTCGGTCTCAGTGC | 615 |
| vp26F4 vp26R4 | ATCCAACCAACACGTAAAGG GGAAAATCTACATCTGTTGTGC | 580 |
| LacZF2 LacZR2 | ACCAGAAGCGGTGCCGGAAA CCACAGCGGATGGTTCGGAT | 1,012 |
| B-ActinF2 B-ActinR2 | GAAGTAGCCGCCCTGGTTG CGGTTAGCCTTGGGGTTGAG | 416 |
| BLOCK-iT.T7 | GATGACTCGTAATACGACTCACTA |
Nguồn : https://www.globalseafood.org/advocate/double-stranded-rna-against-wssv-genes-provides-antiviral-protection-in-shrimp-2/
