Xác định promoter U6, thiết kế gRNA và xây dựng plasmid CRISPR/Cas9 WSSV
Promoter U6 được xác định từ một trình tự phía trên của U6 snRNA (số đăng ký GenBank. QCYY01002896) thông qua việc so sánh với vùng miền bảo tồn của promoter U6 ở các loài khác. Trình tự nucleotide được chọn sau đó được đánh giá để biểu thị khung gRNA. Khung RNA hướng dẫn là một trình tự kết hợp giữa RNA nhận diện mục tiêu, một crRNA nhận diện một động cơ kề bên protospacer (PAM) cụ thể, và tracrRNA, là một trình tự tương tác với Cas9. gRNA cụ thể cho DNA WSSV đã được thiết kế để nhận diện một trình tự PAM. Trình tự PAM của bộ gen WSSV đã được xác định bằng công cụ thiết kế RNA/DNA hướng dẫn CRISPR cho sinh vật nhân thực (EuPaGDT)44, và hai trình tự bộ gen WSSV tại WSSV143 và WSSV360 đã được chọn cho biểu thị khung gRNA.
Một trình tự DNA mã hóa cho hai khung gRNA cụ thể cho bộ gen WSSV kề bên một promoter của tiểu đơn vị ribonucleotide reductase cho biểu thị Caspase 9 đã được sửa đổi trong plasmid pAC-sgRNA-Cas9, và chi tiết trình tự được hiển thị trong Bảng bổ sung S1. Các trình tự DNA cho promoter U6 và gRNAs cụ thể cho WSSV 143 và WSSV 360 kết hợp với một promoter của tiểu đơn vị nhỏ ribonucleotide reductase đã được tổng hợp, nhân bản và chèn vào plasmid pUC57 (General Biosystems, Inc., USA). Các chi tiết và trình tự DNA đề xuất được hiển thị trong Bảng bổ sung S2 và Hình bổ sung S6. DNA chimera đã được tiêu hóa đôi bằng EcoRI và KpnI và được chèn vào vector pAC-sgRNA-Cas9 (Addgene, USA).
Tôm P. Vannamei
Đối với việc nuôi cấy tế bào huyết tôm, tôm P. vannamei không mang mầm bệnh (âm tính RT‒PCR hoặc PCR đối với WSSV, YHV, TSV, IHHNV, DIV1, EHP và V. parahaemolyticus) có kích thước khoảng 30–35 g từ Trại Thủy sản Sibsaen, Tỉnh Chachoensao, được duy trì trong bể nước biển nhân tạo (nồng độ muối 35%) với nguồn thức ăn thương mại hàng ngày. Những con tôm này được sử dụng để thu thập huyết tôm, mà sau đó được nuôi cấy cho các thí nghiệm chuyển gen. Kích thước tôm khoảng 4–6 g được sử dụng cho nhiễm WSSV và điều trị CRISPR/Cas9-WSSV.
Nuôi cấy và chuyển gen tế bào huyết tôm
Tôm được gây mê trên đá lạnh, nhúng vào ethanol 70% lạnh, và sau đó rửa lại bằng nước vô trùng. Năm trăm microlit huyết tương đã được rút từ xoang bụng của mỗi con tôm bằng kim tiêm 22G vô trùng và 500 µl dung dịch trisodium citrate 10% như một dung dịch chống đông. Hỗn hợp tế bào huyết được quay ly tâm ở 3.500 rpm trong 10 phút ở 4 °C để thu thập cặn tế bào huyết. Cặn tế bào huyết được rửa 2 lần với 2X PBS và hòa lại trong môi trường nuôi cấy tế bào huyết (môi trường L-15 của Leibovitz (Gibco, Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, USA), 1% D-glucose (Sigma‒Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA), 0.5% NaCl (Sigma), pH 7.2, bổ sung với 10% huyết tương bò bào thai (FBS) (EMD Millipore Corp), 0.01% penicillin‒streptomycin (Caisson Labs Inc., Smithfield, Utah, USA) và 0.01% amphotericin B (Caisson Labs Inc.))45. Tế bào huyết hòa lại sau đó được phân chia thành nhiều phần để xác định tính sống sót của tế bào huyết thông qua thử nghiệm Trypan blue (Sigma‒Aldrich). Đối với tất cả các thí nghiệm, 2 × 106 tế bào huyết đã được định giống trong một bình nuôi cấy T25 và được nuôi ở 27 °C.
Sau 12 giờ nuôi cấy tế bào huyết sơ cấp, tế bào huyết được rửa bằng môi trường L-15 2X không chứa huyết tương (môi trường L-15 của Leibovitz, 1% D-glucose, 0.5% NaCl, pH 7.2) một lần và sau đó ủ với môi trường đói (môi trường L-15 2X, 10% FBS và 2 mM L-glutamine (Caisson Labs Inc.)) trong 30 phút ở 27 °C. Sau đó, 200 µl plasmid CRISPR/Cas9-WSSV 1 µg/µl được pha loãng với 800 µl môi trường L-15 2X không chứa huyết tương và lọc qua bộ lọc 0.22 μm. Tổng cộng 600 µl CRISPR/Cas9-WSSV đã pha loãng được trộn với 600 µl Cellfectin đã pha loãng (8 µl Reagent Cellfectin II (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) và 92 µl môi trường L-15 2X không chứa huyết tương), trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Tế bào trong mỗi bình được chuyển gen bằng 200 µl dung dịch đã lọc có chứa 1 µg/µl CRISPR/Cas9-WSSV hoặc plasmid pAC-sgRNA (đối chứng âm) và ủ trong 4 giờ. Các tế bào đã chuyển gen được rửa bằng môi trường đói một lần trong 5 phút, và sau đó rửa bằng môi trường L-15 2X không chứa kháng sinh 2 lần, mỗi lần 5 phút, và nuôi cấy với môi trường nuôi ở 27 °C. Sau đó, các tế bào đã chuyển gen từ mỗi nhóm được thu thập sau 12 và 24 giờ bằng cách rửa với 2X PBS lạnh 2 lần trong 5 phút mỗi lần và trypsin hóa với 1 ml 0.25% 1X trypsin-EDTA (Gibco) trong 5 phút ở 37 °C. Các tế bào đã chuyển gen tách ra được chuyển sang ống ly tâm và quay ly tâm ở 3,500 rpm trong 10 phút ở 4 °C. Phần dịch tinh thể được loại bỏ, và cặn tế bào được rửa bằng 2X PBS 2 lần trong 5 phút mỗi lần. RNA được chiết xuất từ cặn tế bào qua TriReagent (Molecular Research Center, Inc., USA) theo theo quy trình của nhà sản xuất và tiến hành tổng hợp cDNA.
Hiệu suất cắt gọt in vitro của các khung gRNA cụ thể đối với mục tiêu DNA WSSV
Việc cắt gọt của khung gRNA cụ thể cho trình tự DNA WSSV 143 và WSSV360 cùng với Cas9 đã được đánh giá sơ bộ với amplicon DNA mục tiêu in vitro như đã được mô tả trước đó46. Các khung gRNA cụ thể cho WSSV143, WSSV360, IHHNV và GFP được tổng hợp bằng tổng hợp RNA. Cas9 tái tổ hợp được biểu thị và tinh chế từ hệ thống vi khuẩn. DNA mục tiêu, bao gồm WSSV143, WSSV360 và IHHNV, được chuẩn bị qua PCR với các mồi cụ thể (Bảng bổ sung S3.). Hỗn hợp phản ứng bao gồm gRNA, Cas9 và amplicon DNA mục tiêu đã được ủ ở 37 °C trong 2 giờ trước khi phân tích điện di gel agarose. Đáng chú ý, gRNAs cụ thể cho GFP và IHHNV đã được sử dụng làm đối chứng âm và dương tương ứng.
Biểu hiện CRISPR/Cas-WSSV và thách thức WSSV trong P. Vannamei
IHHNV-VLP đã được áp dụng để chuyển plasmid CRISPR/Cas9-WSSV vào tôm; nó được chuẩn bị từ protein vỏ IHHNV đã được xây dựng trong vi khuẩn, và việc tinh chế được thực hiện theo một quy trình được mô tả trước đó18. CRISPR/Cas9 WSSV được bao bọc trong IHHNV-VLP được chuẩn bị theo báo cáo trước đó19.
Việc biểu hiện gRNAs và Cas9 trong mô tôm đã được đánh giá ở tôm 5 g, và 10 con tôm đã được tiêm ba lần với 2 µg/g plasmid CRISPR/Cas9 được bao bọc IHHNV-VLP trong thể tích tổng cộng 100 µl. Cephalothorax đã được thu thập sau 24 giờ và 3 ngày sau khi tiêm, và RNA tổng đã được chiết xuất làm mẫu RT‒PCR để phát hiện gRNAs và Cas9. Thí nghiệm đối chứng âm có liên quan đến việc tiêm plasmid pAC-sgRNA, và gen EF-1α được sử dụng làm gen kiểm soát nội bộ.
Vật chủ virus WSSV (2 × 108 bản sao/µl) được hỗ trợ bởi Trung tâm Xuất sắc về Công nghệ và Đổi mới Thủy sản, Đại học Walailak. Đối với nhiễm WSSV thí nghiệm và điều trị CRISPR/Cas9-WSSV, 40 con tôm được chia thành 4 nhóm, và mỗi nhóm được tiêm vào cơ bắp với 0.85% NaCl, 2 µg/g IHHNV-VLP, 2 µg/g CRISPR/Cas9-WSSV hoặc 2 µg/g IHHNV-VLP chứa CRISPR/Cas9-WSSV. Tất cả các hỗn hợp đã được tiêm được chuẩn bị trong dung dịch 0.85% NaCl. Thể tích được điều chỉnh đến 100 µl/tiêm. Sau 24 giờ, bốn nhóm được thách thức với WSSV bằng cách tiêm vào cơ bắp 1 × 103 bản sao pha loãng trong 100 µl 0.85% NaCl. Các nhóm khác được tiêm một thể tích tương đương của 0.85% NaCl cho các nhóm đối chứng. Tất cả các nhóm thí nghiệm đã được tiến hành ba lần. Mẫu mang mang được thu thập để đo lường khả năng nhân lên của WSSV sau 24, 48 và 72 giờ, và mẫu gan và cơ được thu thập để định lượng mRNA biểu hiện các gen liên quan đến miễn dịch tại 0, 6, 12, 24, 48 và 72 giờ.
Tách gen DNA
Vây của P. vannamei được đồng nhất hóa với 500 µl dung dịch lysis TF (50 mM Tris-HCl, pH 9.0; 50 mM NaCl; 100 mM EDTA; 2% SDS; 1 µg/ml proteinase K) và ủ ở 60 °C trong 10 giây. Để chiết xuất DNA, 500 µl phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) được thêm vào mô đồng nhất, được trộn đều bằng lật và sau đó được ly tâm ở 12,000 rpm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Giai đoạn lỏng phía trên được loại bỏ và chuyển đến một ống ly tâm mới 1.5 ml, 500 µl ethanol tuyệt đối lạnh được thêm vào, hỗn hợp được trộn đều, và hỗn hợp được cho đứng trong 10 phút trên đá để lắng đọng DNA gen. Cặn DNA được thu thập bằng cách quay ly tâm ở 12,000 rpm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Phần dịch hấp thu được loại bỏ bằng cách pipet, và DNA cặn được rửa bằng 500 µl ethanol 70% lạnh và quay ly tâm ở 12,000 rpm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, dịch hấp thu được loại bỏ, và DNA cặn được làm khô ở nhiệt độ phòng. DNA khô được hòa tan trong nước vô trùng và định lượng bằng NanoDrop (NanoDrop One, Thermo Fisher Scientific, USA). Mẫu DNA được lưu trữ ở -20 °C cho đến khi phân tích thêm.
Tách RNA tổng và tổng hợp cDNA
RNA tổng đã được chiết xuất từ gan và cơ của P. vannamei bằng TriReagent (Molecular Research Center, Inc., USA) theo quy trình của nhà sản xuất. Việc định lượng và tinh chế RNA được thực hiện bằng máy quang phổ NanoDrop. Mẫu RNA đã được xử lý bằng DNase I (Thermo Fisher Scientific) để loại bỏ DNA nhiễm bẩn. cDNA được tổng hợp từ RNA tổng qua RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất với các mồi ngẫu nhiên hexamer.
RT‒PCR và phân tích PCR từng lúc thời gian thực định lượng
Để xác định các bản sao mRNA của gRNAs, Caspase 9 và Ef-1α đã được sử dụng. RT‒PCR được thực hiện với một mồi cụ thể (Bảng bổ sung S3). Các điều kiện PCR như sau: 95 °C trong 5 phút; 35 chu kỳ khử trùng ở 95 °C trong 30 giây, gắn kết ở 58 °C trong 30 giây và mở rộng ở 72 °C trong 10 phút. Các sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1.5% và được quan sát dưới ánh sáng cực tím (Hệ thống Tài liệu Gel, Omega Fluor™, Gel Company, Inc., USA) với ethidium bromide.
Hỗn hợp PCR định lượng từng lúc thời gian thực bao gồm 10 µl iTaq Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, USA), 0.8 µl các mồi đảo chiều và tiến về 10 µM, và 1 µl mẫu DNA hoặc cDNA (100 ng/µl). Các điều kiện PCR như sau: 95 °C trong 2 phút cho DNA gen và 30 giây cho cDNA, sau đó là 35 hoặc 40 chu kỳ khử trùng ở 95 °C trong 5 phút, gắn kết/mở rộng ở 60 °C trong 30 giây và 5 giây ở 65 °C. Tất cả các phản ứng được thực hiện ba lần, và gen EF-1α được sử dụng làm gen kiểm soát nội bộ tham chiếu. Việc xác định biểu hiện gen được thực hiện trên Hệ thống Phát hiện PCR Thời gian Thực CFX Connect (Bio-Rad, USA). Việc định lượng tương đối của biểu hiện gen được thực hiện thông qua phương pháp CT so sánh (phương pháp 2−ΔΔCT)47.
Phân tích thống kê
Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Tỷ lệ tử vong của các nhóm thí nghiệm và nhóm đối chứng đã được phân tích thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 9.0.0, bao gồm kiểm tra t của Student. Mức độ biểu hiện gen WSSV đã được phân tích thông qua một số phép kiểm t. Các mức độ biểu hiện gen liên quan đến miễn dịch đã được phân tích thông qua ANOVA một chiều theo sau là kiểm tra nhiều khoảng cách mới của Duncan. Ý nghĩa thống kê được chấp nhận ở mức p …
Đạo đức thú y
Tất cả các thủ tục trên động vật đều được thực hiện theo Hướng dẫn về Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Đại học Phayao và được Ủy ban Đạo đức Động vật Đại học Phayao phê duyệt (Số phê duyệt: 64 01 04 009 và 1-009-66).
Nguồn : https://www.nature.com/articles/s41598-024-78277-7
