Đánh giá vi sinh vật probiotic chống lại WSSV

Tôm đã được ngâm với 100X L. johnsonii KD1 đã được bảo vệ đáng kể chống lại WSSV, bắt đầu từ 3 ngày sau khi nhiễm (dpi) và rõ ràng hơn ở 4 dpi, vì tỷ lệ tử vong của tôm thấp hơn so với tôm nhận 1X L. johnsonii KD1 và tôm không nhận probiotic nào (nhóm đối chứng tích cực) (Hình 1A). Điều này nhất quán với tải lượng virus được đánh giá bằng qPCR trên 100 ng DNA tổng số được chiết xuất từ mô của các tôm sống sót, nơi mà số bản sao WSSV không thể phát hiện được (Hình 1B). Vào 5 dpi, tôm điều trị bằng 100X L. johnsonii KD1 cho thấy tỷ lệ tử vong tích lũy thấp nhất (38%) so với tôm điều trị bằng 1X L. johnsonii KD1 (64%) và nhóm đối chứng tích cực (97%) (Hình 1A). Các phát hiện của chúng tôi gợi ý rằng liều cao của L. johnsonii KD1 đã thúc đẩy sống sót của tôm sau khi nhiễm WSSV và cơ chế nội tại liên quan đến hiệu quả bảo vệ của nó vẫn cần được khám phá. Tương tự, P. vannamei điều trị với cùng một liều cao của L. lactis và L. plantarum có thể trì hoãn tỷ lệ tử vong của tôm và giảm sản phẩm virus sau khi nhiễm WSSV. Hơn nữa, tập hợp các probiotic Pediococcus pentosaceus và Staphylococcus hemolyticus trong thức ăn thương mại cho P. vannamei có thể giảm tỷ lệ xuất hiện WSSV xuống dưới 20%. Các probiotic khác như Bacillus megaterium và Bacillus PC465 được sử dụng trong hỗn hợp thức ăn cũng đã được báo cáo là có khả năng kháng nhiễm WSSV ở P. vannamei. Bằng chứng này hỗ trợ khả năng của các probiotic trong việc ức chế nhiễm trùng và sao chép WSSV.

Hình 1

Tỷ lệ tử vong tích lũy của tôm sau khi nhiễm WSSV (A) Trung bình tỷ lệ tử vong tích lũy ± lỗi chuẩn ở tôm ngâm với 4.5 × 10⁸ [1X] CFU/2 L nước biển và 4.5 × 10¹⁰ [100X] CFU/2 L nước biển của L. johnsonii KD1 trong năm ngày với n = 30 tôm mỗi mẫu (ba mẫu/mỗi liều/group) trong khi các nhóm âm tính và dương tính không có điều trị probiotic với n = 30 tôm mỗi mẫu (ba mẫu/group) tiếp theo là nhiễm WSSV ngoại trừ nhóm âm tính. (B) Trung bình số bản sao WSSV ± lỗi chuẩn với 3 tôm sống sót mỗi nhóm được lấy mẫu tại 3 ngày sau khi nhiễm (3 dpi).

Kích hoạt hệ miễn dịch tôm bởi L. johnsonii KD1

Để đánh giá khả năng của L. johnsonii KD1 kích thích hệ miễn dịch tôm, chúng tôi đã chọn bốn gen miễn dịch bẩm sinh của tôm tức là, các gen mã hóa peroxinectin (PX), prophenoloxidase-1 (proPO I), serine protease (SP), và yếu tố chống lipopolysaccharide-1 (ALF-1) và xác định sự biểu hiện gen của tôm ở ngày 6 (1 ngày sau khi cho ăn) và ngày 8 (3 ngày sau khi cho ăn) (Hình 2). Trong nghiên cứu này, chế độ ăn của tôm với 100X L. johnsonii KD1 cho thấy sự gia tăng của PX ở 1.6 và 2.5 lần vào ngày 6 và ngày 8, tương ứng. Một cách nhất quán, sự biểu hiện proPO I tăng lên vào cả hai ngày với 2.1 và 1.8 lần, tương ứng. Mức độ biểu hiện SP và ALF-1 tăng lên vào ngày 8 với 2.7 lần và 1.5 lần, tương ứng.

Hình 2

Biểu hiện gen miễn dịch của tôm của peroxinectin (PX), serine protease (SP), prophenoloxidase-1 (proPO I), và yếu tố chống lipopolysaccharide-1 (ALF-1). Chế độ ăn của tôm với 4.5 × 10¹⁰ [100X] CFU/2 L nước biển của L. johnsonii KD1 trong năm ngày với n = 30 tôm mỗi mẫu (hai mẫu/group) trong khi nhóm âm tính không có điều trị probiotic với n = 30 tôm mỗi mẫu (hai mẫu/group). Trung bình của sự khác biệt bội số ± lỗi chuẩn với n = 4 tôm mỗi nhóm tại ngày 6 (hoặc một ngày sau chế độ ăn probiotic trong các nhóm điều trị) và ngày 8 (hoặc ba ngày sau chế độ ăn probiotic).

Trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tôm, PX tham gia vào nhận diện mầm bệnh, bám dính, và cuối cùng là tiêu diệt trong khi proPO I được kích hoạt thành phenoloxidase-1 bởi SP và các enzym kích hoạt proPO dẫn đến sản xuất melanin và tiêu diệt mầm bệnh. Nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng cả PX và proPO đều được gia tăng khi P. vannamei được điều trị với L. plantarum trong thức ăn hỗn hợp (10⁴ và 10⁷ CFU/g thức ăn). Nhiều SP cũng có thể kích hoạt PPAEs dẫn đến sự kích thích proPO I. Do đó, sự gia tăng của PX, proPO I và SP ở tôm nhận 100X L. johnsonii KD1 có thể tiềm năng loại bỏ WSSV dẫn đến tải lượng virus và nhiễm trùng giảm ở các tôm bị phơi nhiễm. Đối với biểu hiện ALF-1, nghiên cứu trước đó cho thấy rằng Marsupenaeus japonicus (tôm kuruma) được điều trị với L. lactis D1813 trong thức ăn hỗn hợp (10⁵ CFU/g thức ăn) trong 7 ngày đã thể hiện sự gia tăng sau 3 ngày và 6 ngày sau khi cho ăn. ALF-1 là một peptide kháng khuẩn được sản xuất thông qua con đường Toll ở tôm penaeid. ALF-1 có thể kết hợp với protein WSSV và chặn nhiễm trùng WSSV. Do đó, sự gia tăng biểu hiện ALF-1 trong các tôm điều trị bằng 100X L. johnsonii KD1 có thể tiềm năng ngăn chặn nhiễm trùng WSSV.

Đặc điểm di truyền của L. johnsonii KD1

Genome hoàn chỉnh của L. johnsonii KD1 được phát hiện bao gồm một nhiễm sắc thể 1,873,159 bp (khoảng 1.87 Mb) được đặt tên là KD1 và một plasmid 15,425 bp được đặt tên là pLJKD1 với thành phần GC lần lượt là 35% và 34%. BLASTn của plasmid cho thấy 100% đồng nhất với plasmid của L. johnsonii GHZ10a, và 94% đồng nhất với các plasmid pUMNLJ21 của L. johnsonii UMNLJ21, pUMNLJ22 của L. johnsonii UMNLJ22, và pLJPF01S của L. johnsonii pf01. L. johnsonii KD1 chứa 1,783 gene mã hóa (CDS) với 1,390 gene chức năng và 393 gene mã hóa protein giả định. Ngoài ra, đã tìm thấy 12 gene mã hóa rRNA và 74 gene mã hóa tRNA. Tám mươi bảy gene mã hóa các vùng lặp lại và 9 gene transporter đã được xác định và tóm tắt trong Bảng 1. Đối với plasmid pLJKD1, có 21 gene CDS bao gồm 10 gene chức năng và 11 gene mã hóa protein giả định. Các gene của nhiễm sắc thể L. johnsonii KD1 và plasmid đã được phân loại thành các hệ thống con bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu PATRIC với các hệ thống con chính về xử lý protein, trao đổi chất, xử lý DNA và năng lượng được xác định trong nhiễm sắc thể và các hệ thống con chính về năng lượng và phản ứng căng thẳng, phòng thủ và độc lực trong plasmid probiotic.

Hình 3

Genome hoàn chỉnh của L. johnsonii KD1 (A) Bản đồ nhiễm sắc thể (B) Bản đồ plasmid.

Bảng 1

Các đặc điểm di truyền của L. johnsonii KD1.

Xác định gen kháng kháng sinh (AMR)

Gen AMR ermB (99–100% đồng nhất) đã được xác định ở vị trí 1,623,992–1,624,729 trong nhiễm sắc thể probiotic bằng ResFinder-4.1. Các gen ermT, ermA, ermB, ermY, erm46, và ermR sản xuất methyltransferase ribosomal RNA Erm 23S đã được báo cáo là gây ra kháng kháng sinh lincosamide, macrolide và streptogramin b. Đặc biệt, ermB phổ biến trong Lactobacillus và mang lại khả năng kháng erythromycin. Điều này tương ứng với một nghiên cứu khác đã xác định kháng erythromycin phụ thuộc ermB trong L. johnsonii. Do đó, hồ sơ kháng kháng sinh của L. johnsonii KD1 cần được nghiên cứu thêm để xác nhận kiểu hình AMR theo hướng dẫn của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) cho việc đánh giá an toàn ứng dụng probiotic trong phụ gia thức ăn.

Bảng 2

Gen kháng kháng sinh (AMR) được xác định trong L. johnsonii KD1.

Các yếu tố di truyền di động (MGEs) và độc lực

Để xác thực prophages, PHASTER đã được sử dụng để phân tích và cho thấy ba vùng prophages trong nhiễm sắc thể probiotic. Các trình tự mã hóa của prophages cho thấy các gen mã hóa protein phage, transposase, N-acetylglucosaminyltransferase, một methyltransferase, một phosphoesterase, một hydrolase, các điều hòa phiên mã, một transporter ABC, và các protein giả định. Tương tự, 24 trình tự chèn và 5 transposon tổng hợp không có liên quan đến kháng kháng sinh và các yếu tố độc lực đã được xác định bởi MGEfinder. Điều này gợi ý rằng sẽ có ít sự phát tán của kháng kháng sinh và các yếu tố độc lực vào môi trường bởi các yếu tố di truyền di động của L. johnsonii KD1. Ngoài ra, dự đoán độc lực bằng PathogenFinder 1.1 cho thấy không có gen độc lực. L. johnsonii KD1 được dự đoán là một tác nhân không gây bệnh cho người.

Bảng 3

Các yếu tố di truyền di động được xác định trong L. johnsonii KD1.

Xác định và phân tích hệ thống phát sinh của L. johnsonii KD1

Vì nguồn gốc của L. johnsonii KD1 không rõ, chúng tôi đã xác nhận từ phân tích rMLST rằng probiotic này chia sẻ 98% đồng nhất với L. johnsonii. Chúng tôi sau đó đã tiến hành phân tích phát sinh dựa trên 500 gen đơn sao bằng cách so sánh L. johnsonii KD1 với 21 tách L. johnsonii khác trong cơ sở dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy rằng L. johnsonii KD1 có mối quan hệ gần hơn với L. johnsonii GHZ10a được tách từ Sus scrofa hay lợn hoang phổ biến và L. johnsonii ZLJ010 được tách từ phân lợn. Chúng tôi chỉ có thể gợi ý rằng L. johnsonii KD1 có thể có nguồn gốc từ lợn.

Hình 4

Cây phát sinh của các giống L. johnsonii dựa trên 500 gen单-copy bằng RAxML trong Dịch vụ Cây phát sinh BV-BRC phiên bản 3.25.3.

Phân tích di truyền so sánh

So sánh các genome của L. johnsonii KD1 và 21 giống L. johnsonii đã xác định pan genome của 4045 gen bao gồm 1065 gen lõi, 1932 gen phụ trợ và 1048 gen đặc trưng cho giống. L. johnsonii KD1 cho thấy chín gen đặc biệt mã hóa cho protein có khả năng tìm hiểu (late competent protein) COMEA (một thụ thể DNA), một deacetylase chưa xác định, một integrase, các protein giả định và các protein thuộc hệ thống sửa đổi hạn chế loại I. Hệ thống sửa đổi hạn chế là một phần của hệ thống miễn dịch tự nhiên của vi khuẩn và làm việc để bảo vệ DNA của chủ bằng cách ngăn chặn sự cắt đứt qua methyl hóa DNA và cắt DNA ngoại lai bằng hành động của nucleases hạn chế. Các hệ thống sửa đổi hạn chế được phân loại thành loại I-IV, một hệ thống RM loại I bao gồm (1) một đơn vị đặc hiệu S để nhận diện một motif DNA cụ thể, (2) hai đơn vị methyltransferase M để methyl hóa DNA và (3) hai đơn vị endonuclease hạn chế R để cắt đứt DNA không methyl hóa. Loại này cắt đứt các chuỗi cụ thể xa khỏi điểm nhận diện trong khi các hệ thống RM loại II và IV cắt đứt ngay tại một điểm nhận diện. Hệ thống RM loại III cắt đứt các chuỗi DNA tương tự nhưng thiếu một đơn vị đặc hiệu S.

Trước đó, L. johnsonii DPC6026 đã trình bày một hệ thống RM loại III và các yếu tố CRISPR cung cấp khả năng kháng phage. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm thấy các gen mã hóa cho một hệ thống RM loại I và một yếu tố CRISPR bao gồm ba không gian và bốn lặp lại trực tiếp trong L. johnsonii KD1. Điều này do đó gợi ý rằng L. johnsonii KD1 có thể thể hiện tính kháng phage, tuy nhiên, cần có các thử nghiệm bổ sung để điều tra điều này. Bởi vì thực tế rằng sự nhiễm phage có thể được tìm thấy trong thực phẩm và lên men thức ăn trong những môi trường không vô trùng và có thể dẫn đến chất lượng thấp và mất sản xuất, sử dụng probiotic kháng phage có thể vượt qua những vấn đề này và đem lại lợi ích cho sản xuất thực phẩm và thức ăn nói chung.

Kết quả là L. johnsonii KD1 trong nghiên cứu này đã cung cấp hoạt động chống WSSV tốt hơn so với L. plantarum ATCC 14917 theo một nghiên cứu trước đó, các gen của L. johnsonii KD1 đã được so sánh với hai genome của L. plantarum. Công cụ so sánh các lộ trình đã xác định 11 lộ trình đặc trưng của L. johnsonii KD1 được phân loại thành 4 lớp: phân hủy và chuyển hóa xenobiotics, chuyển hóa lipid, tổng hợp các sản phẩm thứ cấp và tổng hợp polyketides và peptide không ribosome. Các lộ trình được xác định chưa hoàn chỉnh, chỉ có một hoặc hai enzym có mặt. Tuy nhiên, một số sản phẩm của các phản ứng enzym được xác định trong các lộ trình có khả năng chống virus. Đây là: Glycolate (axit axetic), 4′- hydroxyacetophenone (hoạt động kháng viêm gan B), 13-OXDE (analogue của axit linoleic, có hoạt động chống WSSV), và Taxol (ức chế virus HIV-1),. Sau đó, chúng tôi đã tìm thấy 582 gen đặc trưng trong L. johnsonii KD1 chẳng hạn như các gen mã hóa hệ thống sửa đổi hạn chế loại I, levansucrase, một transporter bacteriocin ABC với thành phần kết nối ATP và permease, và một transporter bacteriocin ABC với protein phụ trợ. Tuy nhiên, 268 trong số các gen đặc trưng trong L. johnsonii KD1 đã được xác định là giả định. Để xác định chức năng cho các protein này, công cụ dòng lệnh MicrobeAnnotator đã được sử dụng. Điều này đã chú thích 44 trong số 268 gen đặc trưng liên quan đến tổng hợp thành tế bào, glycosyl hóa và tổng hợp lipopolysaccharide, nhiều loại transporter và 16 protein virus. Điều này gợi ý ba khả năng; (1) các protein được chú thích là protein virus có thể chia sẻ đồng nhất với protein virus nhưng không chia sẻ cùng chức năng; (2) probiotic đã thu nhận những protein này và tiềm năng sử dụng chúng để thực hiện chức năng trong tế bào hoặc (3) giống có thể trình bày các protein màng virus trên bề mặt của chúng như một phương pháp để tổ chức phản ứng miễn dịch chống lại virus. Do đó gợi ý rằng các protein/chất chuyển hóa khác nhau có thể được sản xuất bởi L. johnsonii KD1 so với L. plantarum ATCC 14917, cái mà có thể cung cấp cho tôm một mức độ bảo vệ cao hơn chống lại WSSV.

Hơn nữa, để điều tra những khác biệt tiềm năng trong việc sử dụng carbohydrate giữa hai giống này, các enzym hoạt động carbohydrate (CAZymes) đã được chú thích bằng cách sử dụng máy chủ web dbCAN. Các gen có thể được phân loại là thuộc về glycoside hydrolases (GHs), glycosyltransferases (GTs), polysaccharide lyases (PLs), carbohydrate esterases (CEs), hoạt động phụ (AAs) và các module gắn carbohydrate (CBMs). Các lớp này có thể được phân loại thêm dựa trên tính đồng nhất của chuỗi amino acid. Như đã thấy trong Hình 5, một loạt các gia đình CAZymes khác nhau đã được xác định và cả hai genome L. plantarum ATCC 14917 đều có hồ sơ giống nhau. Tuy nhiên, khi so sánh L. johnsonii KD1 và L. plantarum ATCC 14917 có những khác biệt về tần suất tương đối và các gia đình đã được xác định. Ngoài ra, các genome L. plantarum đều chứa gấp đôi số lượng CAZymes hơn L. johnsonii KD1 (99 và 50 tương ứng). Điều thú vị là, 10% CAZymes của L. johnsonii thuộc về gia đình GT8 (6% GT8, 4% GT8 + GT101), trong khi không có CAZymes nào được xác định trong L. plantarum ATCC 14917. Các hoạt động liên quan đến GT8 là lipopolysaccharide, inositol, homogalacturonan, UDP-GlcA: xylan và UDP-Gal: glucoside glycosyltransferases. Một ứng dụng khác của việc chú thích máy chủ dbCAN2 là xác định các cụm gen CAZyme (CGC) là các cụm gen làm việc cùng nhau để tiêu hóa hoặc sử dụng carbohydrate. Một trong những cụm gen được xác định trong L. johnsonii KD1 chứa hai gen GT8 + GT101 và 6 gen transporter, điều này có thể trình bày một phương pháp tổng hợp và xuất khẩu lipopolysaccharide. Sự khác biệt được quan sát giữa các hồ sơ CAZymes của L. johnsonii KD1 và L. plantarum ATCC 14917 cho thấy sự khác biệt trong việc sử dụng carbohydrate giữa hai giống này. Hơn nữa, sự xuất hiện của GT8 chỉ trong L. johnsonii KD1 gợi ý rằng lớp enzym này có thể rất quan trọng trong việc thực hiện ảnh hưởng probiotic được quan sát. Thêm vào đó, vì gia đình GT8 chứa các enzym liên quan đến tổng hợp lipopolysaccharide, bề mặt của L. johnsonii KD1 có thể hiển thị các lipopolysaccharides khác nhau so với L. plantarum ATCC 14917, cái mà có thể có tính chất probiotic. Hơn nữa, cụm gen tiềm năng xác định trong genome của L. johnsonii KD1 gợi ý một cơ chế tiềm năng về sửa đổi và xuất khẩu carbohydrate. Công việc thêm có thể được thực hiện để điều tra con đường này và liên kết tiềm năng của nó với ảnh hưởng probiotic của giống.

Hình 5

Các hồ sơ CAZymes. Các genome L. johnsonii KD1 và hai genome L. plantarum ATCC 14917 đã được chú thích qua máy chủ web dbCAN2. Đã sản xuất biểu đồ nhiệt về (A) tổng số các gen được chú thích là CAZymes trong các gia đình tương ứng của chúng và (B) tỷ lệ phần trăm của mỗi gia đình so với tổng số CAZymes được xác định trong mỗi genome. (C) Gen GT8 + GT101 chứa cụm CGC được xác định trong genome của L. johnsonii KD1 (hình ảnh được tạo ra bởi máy chủ web dbCAN2); transporter (màu xanh), CAZyme (màu đỏ), và các gen không có chữ ký/chưa chú thích (màu xám).

Độ bền probiotic trong điều kiện nuôi trồng thủy sản và đường ruột (GI)

Các probiotic bị phơi nhiễm với căng thẳng muối trong nước trong quá trình cho ăn và bởi các muối mật trong GI của tôm do gan tụy của tôm sinh ra, điều này có thể gây chết cho một số vi khuẩn. Trước đây, các probiotic, đặc biệt là LABs, được thấy có khả năng kháng lại độ mặn và muối mật. Do đó, các genome của các chủng kháng muối của L. plantarum (D31 và T9) chứa các gen kháng muối như các gen mã hóa cho các antiporter sodium/proton (Na+/H+) chịu trách nhiệm điều chỉnh pH nội bào bằng cách thoát Na+ ra khỏi tế bào, một protein hệ thống vận chuyển kali, Kup, tham gia vào ổn định ion trong điều kiện căng thẳng thẩm thấu cao và yếu tố điều hòa phiên mã LysR và yếu tố sigma RNA polymerase RpoD tham gia vào cân bằng chuyển hóa nội bào trong điều kiện căng thẳng muối. Trong nghiên cứu này, bốn gen mã hóa Na+:H+ antiporters, hai gen mã hóa hai protein hệ thống vận chuyển kali Kup và hai yếu tố điều hòa; một yếu tố từ gia đình LysR và yếu tố sigma RNA polymerase RpoD đã được xác định trong L. johnsonii KD1. Do đó, trình bày các cơ chế kháng muối của L. johnsonii KD1. Hơn thế nữa, L. johnsonii KD1 cũng đã tiết lộ ba gen mã hóa choloylglycine hydrolases hoặc bile salt hydrolases. Muối mật hydrolases khử liên kết muối mật dẫn đến giải phóng một nhóm acid amin từ lõi steroid, cái đã được chứng minh để tăng cường sinh vật khuẩn cư và sự sống còn trong đường tiêu hóa. Ví dụ, L. acidophilus NCFM chứa các gen mã hóa cho bile salt hydrolases và thể hiện hoạt động hydrolases muối mật. Tương tự, L. johnsonii ZLJ010 và L. johnsonii CNCM I-4884 cho thấy các gen mã hóa cho Na+:H+ antiporters và choloylglycine hydrolases. Đặc biệt, L. johnsonii CNCM I-4884 đã trình bày hoạt động hydrolases muối mật mạnh.

Thêm vào đó, các protein phản ứng sốc nhiệt và Clp proteases có thể sửa chữa và tái gập protein bị tổn thương trong phản ứng với căng thẳng. Hơn nữa, protein hệ thống UvrABC B và helicase DNA phụ thuộc ATP UvrD/PcrA đã được báo cáo là tham gia vào việc sửa chữa DNA. Từ nghiên cứu này, genome của probiotic L. johnsonii KD1 cho thấy các gen mã hóa cho protein phản ứng sốc nhiệt, Clp proteases, và sửa chữa DNA. Tương ứng với các nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng các genome của L. johnsonii ZLJ010 và CNCMI-4884 chứa các gen mã hóa cho protein phản ứng sốc nhiệt GroEL, DnaK, và DnaJ, và các gen mã hóa cho các protease nội bào phụ thuộc ATP ClpP. Điều này gợi ý rằng các gen này thúc đẩy sự sống còn của L. johnsonii KD1 trong ao tôm và sự cư trú trong ruột tôm.

Yếu tố quan trọng khác đối với các probiotic là khả năng xây dựng trạng thái trong ruột của vật chủ. Điều này được trung gian bởi khả năng của sinh vật bám vào bề mặt các tế bào ruột. Hơn nữa, một cơ chế kháng virus tiềm năng probiotic thông qua việc can thiệp vào sự gắn kết và xâm nhập của virus bằng cách cạnh tranh cho các vị trí gắn kết tế bào. Trong những năm gần đây, một số protein bề mặt tế bào cần thiết cho sự bám dính này đã được đánh giá, do đó cho phép tạo ra một danh sách các protein bám dính tế bào được xác định trong các loài Lactobacillus. Sự hiện diện của các protein này/homologs trong L. johnsonii KD1 và hai genome L. plantarum đã được đánh giá bằng cách sử dụng công cụ BV-BRC BLASTp. Một biểu đồ nhiệt hiển thị giá trị bit-score của các hit hàng đầu được tạo ra bởi BLASTp đã được sản xuất (Hình 6). Từ các protein bám dính tế bào được thử nghiệm, các giống L. plantarum chứa nhiều protein bám dính tế bào hơn, do đó gợi ý rằng các giống L. plantarum này có khả năng cao hơn để bám dính vào các tế bào của ruột và rằng các tính chất kháng virus của L. johnsonii KD1 không phải là do khả năng tốt hơn của giống để bám dính vào các tế bào của ruột để chặn vật lý nhiễm virus. Tuy nhiên, chỉ có một số protein bám dính đã được thử nghiệm trong thí nghiệm này, có nghĩa là L. johnsonii KD1 có thể chứa các protein bám dính khác không được xác định ở đây. Các thí nghiệm trong tương lai có thể được thực hiện để nghiên cứu độ bám dính của các giống khác nhau đối với các loại tế bào ruột và sự phủ bề mặt của mỗi giống trong ruột của tôm. Điều này sẽ cho phép hiểu rõ hơn khả năng mỗi giống để bám dính vào ruột của tôm và liên kết tiềm năng của nó với ảnh hưởng probiotic kháng virus được thể hiện bởi L. johnsonii KD1.

Hình 6

Bản đồ nhiệt protein bám dính tế bào. Một bản đồ nhiệt của các protein bám dính tế bào được xác định trong các genomes của L. johnsonii KD1 và hai L. plantarum ATCC 14917 đã được tạo ra bằng cách sử dụng giá trị bit-score BLASTp cho sự liên kết hàng đầu được tạo ra cho mỗi protein. Các protein nằm trên dòng thuộc về các protein gắn kết mucus/collagen/fibronectin. Các protein nằm dưới dòng thuộc về các protein bám dính tế bào moonlighting.

Chất chuyển hóa với những hoạt động tiềm năng chống virus

Trước đây, các chất chuyển hóa như axit lactic, exopolysaccharides, và các hợp chất kháng khuẩn đã được chứng minh là có khả năng ức chế virus. Axit lactic, một sản phẩm cuối cùng của chuyển hóa carbohydrate, đóng vai trò trong hệ miễn dịch bẩm sinh và có mặt trong tất cả các Lactobacillus. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng izomer axit lactic D và L có thể ức chế sự sao chép của virus suy giảm miễn dịch ở người loại 1 (HIV-1) và virus herpes simplex loại 2 (HSV-2). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm thấy các gen mã hóa d-lactate dehydrogenase, chịu trách nhiệm cho sản xuất d-lactate và l-lactate dehydrogenase, chịu trách nhiệm cho sản xuất l-lactate. Cả hai izomer này đều là các gốc là axit lactic, gợi ý rằng probiotic L. johnsonii KD1 có thể sản xuất d-lactate và l-lactate có thể ức chế WSSV.

Thứ hai, EPS được sản xuất bởi LAB là các polymer tự nhiên của đường/cacbohydrate và tham gia vào sự bám dính vào đường tiêu hóa của vật chủ để xây dựng, hình thành màng sinh học, và hoạt động kháng virus như ức chế nhiễm virus và sự sao chép trong Virus Adeno người loại 5 và rotavirus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện BLASTn genome của L. johnsonii KD1 bằng cách sử dụng các gen eps của L. johnsonii FI9785 làm truy vấn. Điều này đã xác định cụm gen eps cốt lõi của epsABCDE tham gia vào tổng hợp EPS, bao gồm LytR-regulator phiên mã, protein polymerization và xác định độ dài chuỗi, kinase tyrosine, phosphohydrolase protein-tyrosine-phosphate, và galactosephospho-transferase undecaprenyl-phosphate. Tương tự, gen glf mã hóa UDP-galactopyranase mutase, gen epsU mã hóa oligosaccharide translocase, và năm gen mã hóa glycosyltransferases cũng được phát hiện. Điều này tương tự như các cụm gen eps tìm thấy trong L. johnsonii FI9785. Điều này gợi ý rằng khả năng sản xuất exopolysaccharides của L. johnsonii KD1 có thể là một cơ chế tiềm năng để ức chế nhiễm virus WSSV. Hơn nữa, inulin là một loại EPS đã tăng cường hoạt động PO và giảm tỷ lệ WSSV ở P. vannamei. Thêm vào đó, inulin đã tăng cường phản ứng miễn dịch của tôm và thay đổi microbiota đường ruột. Inulin và levan được sản xuất bởi enzym inulosucrase và levansucrase, tương ứng, với cả hai enzym thuộc về họ fructosyltransferases. Chúng tôi đã phát hiện rằng L. johnsonii KD1 chứa một gen mã hóa fructosyltransferase được chú thích là levansucrase ở vị trí 1,288,765–1,291,003. Tuy nhiên, L. johnsonii NCC 533 cũng chứa một gen fructosyltransferase (ftf) được chú thích là levansucrase có thể sản xuất inulin. Do đó, chúng tôi đã thực hiện BLASTp protein này so với cơ sở dữ liệu UniProt, cho thấy một hit với độ đồng nhất 72.5% và một hit 54.6% với levan và inulosucrase tương ứng. Điều này gợi ý rằng L. johnsonii KD1 có thể sản xuất levan hoặc inulin, có thể ức chế WSSV.

Thứ ba, các peptide kháng khuẩn như bacteriocins đã được chứng minh là có khả năng ức chế nhiễm virus, sự sao chép và điều chỉnh hệ miễn dịch của vật chủ. Để đánh giá liệu một cơ chế tiềm năng mà L. johnsonii KD1 thực hiện tính chất kháng virus của nó thông qua việc biểu hiện một sản phẩm tự nhiên, hai công cụ xác định sản phẩm tự nhiên, AntiSMASH và BEGEL đã được sử dụng để phân tích các genome của L. johnsonii KD1 và L. plantarum ATCC 14917. Điều này đã xác định trong L. johnsonii KD1, một homolog của bacteriocin helveticin-J ban đầu được sản xuất bởi Lactobacillus helveticus 481 và một cụm gen sinh tổng hợp (BGC) mà 55% các gen có sự tương tự với BGC của gassericin T. Tuy nhiên, cụm chứa sự đồng nhất với gassericin T thiếu sự hiện diện của các peptide hoạt động GatA và GatX. Ngoài ra, phân tích BLASTp không xác định được homolog của GatA hoặc GatX trong genome của L. johnsonii KD1. Phân tích thêm các gen xuôi đã xác định một yếu tố di truyền di động, hai protein miễn dịch bacteriocin và một homolog của holin. Điều này thú vị vì holins được mã hóa bởi bacteriophage để tạo lỗ trong màng tế bào vi khuẩn, cho phép phát hành endolysins để phá hủy thành tế bào và gây ra cái chết. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng bên ngoài holin và một endolysin từ một phage gọi là SMP có thể làm ly giải các tác nhân gây bệnh như Staphylococcus aureus và Streptococcus suis. Điều này có thể mở ra một cơ chế cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong trường hợp thiếu GatA/GatX.

Hình 7

Các cụm gen sinh tổng hợp được xác định bởi antiSMASH và BAGEL. (A) Bacteriocin helveticin-J homolog và khu vực lân cận gen được xác định bởi BAGEL. (B) Cụm gassericin T chứa holin được xác định bởi antiSMASH. (C) Cụm gassericin T từ Lactobacillus gasseri.

BAGEL4 dự đoán sự hiện diện của một protein 352 amino acid, với 44.5% sự tương đồng chuỗi với bacteriocin helveticin-J đã biết. Tuy nhiên, BLASTp của chuỗi dự đoán chống lại genome của L. johnsonii KD1 xác định một hit với 94% đồng nhất với truy vấn, với dự đoán của BAGEL4 chứa một mở rộng 21 amino acid ở đầu N. Điều này là do phần mềm BAGEL4 dự đoán mã khởi đầu là TTG (Leucin), trong khi BV-BRC RASTtk dự đoán chuỗi bắt đầu từ ATG xuôi xuống (Methionin). Hơn nữa, xuôi của homolog helveticin-J là hai protein vận chuyển chưa xác định và một protein kháng đa kháng, điều này do đó trình bày một phương pháp xuất khẩu và miễn dịch với tác động của protein.

Cụm gen chứa holin trình bày một cơ chế kháng khuẩn tiềm năng của L. johnsonii KD1. Điều này gợi ý rằng protein này ít có khả năng liên quan trực tiếp đến ức chế WSSV và có thể tác động gián tiếp bằng cách ảnh hưởng đến microbiome ruột. Ngược lại, homolog bacteriocin helveticin-J đưa ra một cơ chế ức chế WSSV tiềm năng trực tiếp, vì các bacteriocin có tính chất kháng virus đã được quan sát.

Một cơ chế mà qua đó các bacteriocin có thể thể hiện các thuộc tính kháng virus của chúng là thông qua việc chặn các vị trí thụ thể tế bào chủ và ngăn cản sự xâm nhập virus. Khả năng của homolog helveticin-J can thiệp vào sự gia nhập tế bào qua VP28 đã được đánh giá thông qua docking protein-protein. Để có thể mô hình hóa những sự tương tác tiềm năng này, các cấu trúc 3D của các protein cần thiết. Các cấu trúc của monomer và trimer của VP28 (cả hai đều được xác định bằng X-ray crystallography) đã được tải xuống từ Phyre2 và RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB), tương ứng. Hơn nữa, cơ sở dữ liệu cấu trúc protein AlphaFold chứa một mô hình được tạo ra bởi AlphaFold V2 của một protein có 100% đồng nhất với homolog helveticin-J được xác định bởi BV-BRC (Lj_peg_533) có tên Q74KQ5. Ngoài ra, hai mô hình của homolog helveticin-J (Lj_6.3) đã được tạo ra bằng cách sử dụng phần mềm AlphaFold2 của google collab, một cái sử dụng mô hình PDB70 và một cái không có mô hình (Lj_6.3.1 và Lj_6.3.2, tương ứng). Cả hai mô hình đều tương tự nhau với RMSD là 0.003. Hơn nữa, cấu trúc dự đoán của AlphaFold của PmRab7 đã được sử dụng, vì nó đã được chứng minh là tương tác với monomer của VP28.

Tiếp theo, máy chủ docking protein LZerD đã được sử dụng để tạo ra các mô hình docking của mỗi ligand tiềm năng (PmRab7, Lj_6.3.1, Lj_6.3.2 và Q74KQ5) với monomer và trimer của VP28. Như đã thấy trong Hình 8, tất cả các ligand tiềm năng đều gắn ở cùng một vùng của cả monomer và trimer VP28, do đó gợi ý rằng nếu những tương tác này xảy ra, homolog helveticin-J có thể có khả năng ngăn chặn tương tác PmRab7 và VP28. Điều này có thể do đó ngăn chặn nhiễm virus WSSV, vì sự gắn kết của PmRab7 với VP28 đã liên quan đến nhiễm WSSV ở P. monodon. Hơn nữa, P. vannamei có một protein Rab7 với 100% đồng nhất với PmRab7, vì vậy sự tương tác này cũng có thể bị chặn trong sinh vật này. Ngoài ra, vì PmRab7 liên quan đến sự vận chuyển nội bào, điều này đưa ra một cơ chế khác để ngăn chặn xâm nhập virus. Tuy nhiên, docking protein LZerD hoạt động trên giả định rằng cả hai protein đều tương tác. Do đó, các mô phỏng động học phân tử nên được thực hiện để đánh giá khả năng tương tác của mỗi mô hình của homolog helveticin-J với VP28.

Hình 8

Các mô hình và điểm tương tác của LZerD VP28 và ligand. (A) Các mô hình được sản xuất cho VP28 monomer và trimer tương tác với PmRab7, Q74KQ5 và Lj_6.3.2. (B) Điểm số từng cá nhân và điểm tổng hợp cho mỗi mô hình.

Cuối cùng, nghiên cứu này gợi ý các cơ chế tiềm năng đứng sau các thuộc tính chống WSSV được thể hiện bởi L. johnsonii KD1. Do đó, danh sách các chất chuyển hóa được xác định trong nghiên cứu này sẽ được xem xét và thử nghiệm cho sự ức chế WSSV nhằm xác định các cơ chế chống WSSV cụ thể.

Nguồn : https://www.nature.com/articles/s41598-023-47897-w