Kết quả cho thấy thịt tôm không lây nhiễm sau khi luộc quá 1 phút

Bệnh đốm trắng (WSD), do virus hội chứng đốm trắng (WSSV) gây ra, là một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với ngành nuôi tôm. WSD gây ra tỷ lệ tử vong cao có thể đạt tới 100% ở các quần thể tôm miễn dịch đặc biệt (SPF) trong điều kiện nuôi lớn chỉ trong vài ngày. WSSV lần đầu tiên được báo cáo ở Đài Loan vào năm 1992. Kể từ đó, các trường hợp tôm bị nhiễm WSSV đã được báo cáo ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Đông Nam Á, Nam Á, Địa Trung Hải, Trung Đông, châu Mỹ và Úc.

Nguy cơ giới thiệu WSSV chủ yếu là do sự di chuyển quốc tế giữa các quốc gia sản xuất và nhập khẩu tôm bị nhiễm, cho dù chúng còn sống hay đông lạnh – đầu tôm nguyên (HO), đầu tôm còn vỏ (HOSO) hoặc không đầu nhưng còn vỏ (HLSO) – hoặc dưới dạng sản phẩm đã được nấu chín. Do nguy cơ vô tình đưa vào các mầm bệnh tôm thông qua các sản phẩm hàng hóa, một số quốc gia – bao gồm Úc, Vương quốc Ả Rập Saudi và những nước khác – đã thực hiện các quy trình nghiêm ngặt quy định việc nhập khẩu tôm và sản phẩm tôm sống. Việc sàng lọc để xác định sự hiện diện và/hoặc vắng mặt của một số nguyên nhân virus được thực hiện thông qua phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Thông thường, nếu lô hàng dương tính, sản phẩm sẽ bị tiêu hủy hoặc được điều trị (nấu chín).

Gần đây, tôm đã nấu chín nhiễm WSSV đã có kết quả dương tính bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào để xác định khả năng lây nhiễm của WSSV trong tôm đã nấu chín có kết quả dương tính bằng PCR. Một số nghiên cứu đã công bố rằng các sản phẩm tôm đông lạnh là một phương tiện đưa WSSV vào châu Mỹ vào năm 1995, nhưng chỉ có một vài công trình được bình duyệt làm nổi bật nguy cơ lây nhiễm của WSSV đối với tôm hàng hóa đã được nấu chín. Tuy nhiên, các nghiên cứu này đã hạn chế các phát hiện của họ đối với việc phát hiện WSSV bằng PCR và vẫn chưa rõ liệu tôm đã nấu chín mà chứa các chuỗi DNA virus có lây nhiễm hay không. Mục đích của nghiên cứu của chúng tôi – được hỗ trợ bởi Phòng thí nghiệm Bệnh Thủy sản tại Đại học Arizona – là đánh giá khả năng lây nhiễm của tôm bị nhiễm WSSV khi nấu chín.

Thiết lập nghiên cứu

Tôm trong nghiên cứu đến từ một cơ sở nuôi tôm thương mại ở Hoa Kỳ. Tổng cộng 250 con tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương SPF (Litopenaeus vannamei) có trọng lượng trung bình 10 gram đã được sử dụng. Trọng lượng mẫu này đại diện cho trọng lượng điển hình của tôm trong ao khi thu hoạch khẩn cấp được thực hiện tại các trang trại tôm nơi WSSV đang hoành hành và một đợt bùng phát dịch sắp xảy ra.

Để sản xuất tôm bị nhiễm WSSV, một thử nghiệm thách thức WSSV đã được thực hiện thông qua đường miệng bằng cách cho ăn các mô tôm đã được xác nhận nhiễm WSSV băm nhỏ cho tôm SPF L. vannamei. Việc này được thực hiện với 10% trọng lượng cơ thể của các sinh vật SPF chia thành hai khẩu phần (buổi sáng và buổi tối) trong một ngày. Nước trong các bể thí nghiệm được giữ ở độ mặn 25 ppt và nhiệt độ 25 độ C. Sau thử nghiệm thách thức, tỷ lệ tử vong được đánh giá mỗi giờ. Tôm SPF L. vannamei được cho ăn mô khỏe mạnh và đóng vai trò là nhóm đối chứng âm tính.

Một khi tỷ lệ tử vong của tôm đạt 50%, các sinh vật còn sống được thu hoạch để mô phỏng thu hoạch khẩn cấp và bị cho chết. Mẫu mang và chân bơi được thu thập và bảo quản để xác nhận bằng các xét nghiệm PCR thông thường và thời gian thực. Năm con tôm có triệu chứng lâm sàng được cố định và bảo quản để phân tích mô học (Hình 1).

Quần thể tôm bị nhiễm ban đầu được chia thành sáu nhóm, mỗi nhóm có 40 con; mỗi nhóm được chỉ định một khoảng thời gian luộc cụ thể (trong nước ngọt) là 0, 1, 3, 5, 10 và 30 phút. Một nhóm không bị nhiễm WSSV là nhóm đối chứng âm tính. Mỗi nhóm tôm 40 con được chia thành hai tiểu nhóm với hai lặp lại mỗi nhóm. Tiểu nhóm 1 được luộc theo các khoảng thời gian khác nhau (0, 1, 3, 5, 10 và 30 phút) trước khi cho ăn cho tôm SPF L. vannamei. Tiểu nhóm 2 cũng được luộc trong các khoảng thời gian khác nhau (0, 1, 3, 5, 10 và 30 phút) nhưng được đông lạnh (ở -20 độ C) trong 14 ngày trước khi được cho ăn đợt tôm SPF (Hình 2).

Nhiệt độ trong mô tôm được thu thập bằng cách sử dụng nhiệt kế được đặt bên trong cơ bắp đuôi, và dữ liệu nhiệt độ bên trong được thu thập trước và sau quá trình nấu. Sau khi luộc, các mẫu được để nguội một chút và sau đó các mẫu mang và chân bơi được thu thập và bảo quản để phân tích thêm cả PCR và qPCR (PCR định lượng là phiên bản cải tiến của PCR truyền thống và được sử dụng để phát hiện và định lượng axit nucleic cho nhiều ứng dụng).

Để xác định khả năng gây bệnh của tôm đã nấu chín, một thử nghiệm thách thức đã được tiến hành với quần thể tôm SPF. Mỗi bể 90 lít chứa 10 con tôm non (2 đến 3 gram). Từ mỗi lần lặp lại cho mỗi khoảng thời gian, mô tôm bao gồm dạ dày, mang và chân bơi được cắt nhỏ từ tất cả tôm và băm nhuyễn. Mô băm nhỏ được thêm vào bể theo hai khẩu phần (buổi sáng và buổi tối) chiếm 10% tổng trọng lượng cơ thể của quần thể tôm SPF sống trong một ngày. Thời gian thử thách kéo dài từ 11 đến 12 ngày. Tỷ lệ tử vong hàng ngày được ghi lại, và những mẫu ghép từ mang/chân bơi của tôm sắp chết được thu thập và bảo quản để sử dụng cho việc phát hiện WSSV bằng qPCR và PCR. Ngoài ra, tôm sắp chết được cố định trong dung dịch cố định Davidson để phân tích mô học.

Tỷ lệ sống sót tạm thời cuối cùng được xác định vào cuối thử thách. Mẫu của chân bơi của tất cả tôm được gom lại theo từng bể và bảo quản trong ethanol 95% để phân tích qPCR và PCR. Hai con tôm từ mỗi bể được cố định trong dung dịch cố định Davidson để phân tích mô học. Tôm đông lạnh trong hai tuần (Nhóm 2) được dùng để thực hiện một thử nghiệm thách thức nhiễm WSSV tương tự sử dụng cùng một phương pháp đã mô tả ở trên.

Để biết thông tin chi tiết về thiết kế thí nghiệm; nhiễm trùng thí nghiệm trên tôm, lấy mẫu và ghép mẫu, và luộc các mẫu; thử nghiệm thách thức WSSV; chiết xuất DNA; phân tích PCR và qPCR; và bệnh lý mô học, hãy liên hệ với tác giả tương ứng.

Kết quả

Mô tôm bị nhiễm WSSV được thêm vào bể thí nghiệm với quần thể tôm có trọng lượng 10,5 gram ± 1 gram đã gây ra tỷ lệ tử vong cao. Nhóm tôm đầu tiên bắt đầu chết vào ngày thứ 2 sau khi nhiễm (d.p.i). Vào ngày thứ 4 d.p.i, khi tỷ lệ tử vong đạt 50%, các sinh vật sống sót được thu hoạch. Tôm được cố định bằng dung dịch Davidson đã được xác nhận dương tính với WSSV bằng PCR và H&E (nhuộm hematoxylin và eosin, hoặc nhuộm H&E, là một trong những thuốc nhuộm mô chính được sử dụng trong bệnh lý học, nghiên cứu về giải phẫu vi mô của các mô sinh học; xem Hình 1). Ba mươi con tôm thu được trong quá trình thử thách đã được để trên đá, sau đó được lấy mẫu và xác nhận dương tính với WSSV bằng qPCR và PCR lồng (một biến thể của PCR được thiết kế để cải thiện độ đặc hiệu và độ nhạy).

Tôm bị nhiễm WSSV đã được tiếp xúc với các thời gian luộc khác nhau (0, 1, 3, 5, 10 và 30 phút). Cuối quá trình luộc, các mẫu mang và chân bơi được lấy để phân tích PCR và qPCR. Bảng 1 tổng hợp kết quả qPCR và PCR lồng cho WSSV không đông lạnh và đông lạnh trong hai tuần. Các mẫu thu được khi nấu trong các khoảng thời gian khác nhau cho kết quả dương tính với WSSV qua qPCR. Ngược lại, không có mẫu nào cung cấp bất kỳ sự khuếch đại nào qua PCR lồng.

Aranguren, tôm nấu chín, Bảng 1a

Bảng 1a. Tóm tắt kết quả qPCR và PCR lồng thu được từ DNA được phân lập từ mẫu tôm tiếp xúc với các khoảng thời gian luộc khác nhau.

Trong nhóm điều trị 1, mô tôm bị nhiễm WSSV và tiếp xúc với các khoảng thời gian luộc khác nhau đã được sử dụng làm mầm bệnh trong thử nghiệm thách thức per os sử dụng tôm SPF L. vannamei. Bảng 2 tóm tắt tỷ lệ sống sót của tôm sau 10 d.p.i.

Chỉ có tỷ lệ tử vong cao được phát hiện trong các bể tôm dương tính với WSSV (luộc 0 phút). Kết quả H&E và PCR xác nhận sự hiện diện của WSSV trong các bể đó. Kết quả tương tự đã được thu được khi tôm đã nấu chín được đông lạnh trong hai tuần và sau đó được sử dụng làm nguồn vật liệu gây nhiễm.

Các mẫu thu được cho H&E từ các điều trị khác nhau vào cuối thí nghiệm đã được phân tích. Các thể thân nằm trong nhân tế bào nhuộm basophilic của WSSV trong các nhân phình to đã được tìm thấy trong một số mô bị ảnh hưởng có nguồn gốc từ ngoài bì và trung bì. Hình 3 cho thấy các tổn thương mô học điển hình của WSSV độ 4.0 trong biểu mô cắt dạ dày từ bể đối chứng dương tính. Ngược lại, không có tôm nào được cho ăn mô tôm đã luộc trong các khoảng thời gian khác nhau (1, 3, 5, 10 và 30 phút) cho thấy bất kỳ tổn thương mô học nào điển hình của nhiễm WSSV.

Các mẫu của tôm non bị nhiễm thực nghiệm với tôm đã nấu chín có kết quả dương tính bằng qPCR cho WSSV đều âm tính trong tất cả các trường hợp (Bảng 3).

Aranguren, tôm đã nấu chín, Bảng 3

Bảng 3. Tóm tắt kết quả qPCR trong tôm SPF bị thách thức với tôm nhiễm WSSV tiếp xúc với các khoảng thời gian luộc khác nhau.

Thảo luận

Kết quả của chúng tôi chứng minh rằng tôm nhiễm WSSV tiếp xúc với nhiệt độ luộc trong các khoảng thời gian từ 1 đến 30 phút không lây nhiễm. Dữ liệu qPCR xác nhận sự hiện diện của DNA WSSV trong tất cả các mẫu tiếp xúc với các khoảng thời gian luộc khác nhau, và không tìm thấy sự khác biệt đáng kể về giá trị Ct (ngưỡng chu trình, số chu kỳ khi độ huỳnh quang của một sản phẩm PCR có thể được phát hiện vượt lên trên tín hiệu nền) giữa các khoảng thời gian luộc khác nhau (P<0.05). Tuy nhiên, không có mẫu nào cho kết quả khuếch đại thành công qua PCR lồng WSSV.

Kết quả qPCR cho thấy kết quả dương tính, điều này mâu thuẫn với các kết quả âm tính từ PCR lồng. Có khả năng rằng DNA WSSV được phân lập từ tôm đã nấu chín đã trải qua hư hỏng đáng kể dẫn đến chất lượng giảm và bị phân mảnh hơn so với các mẫu được thu hoạch tươi. Kích thước dự kiến của sản phẩm khuếch đại bước 1 trong PCR lồng (một đoạn DNA là sản phẩm của các sự kiện khuếch đại hoặc nhân bản) là 1,447 bp, và sản phẩm khuếch đại bước 2 nội bộ là 941 bp. Sự vắng mặt của các sản phẩm khuếch đại 1,447-bp và 941-bp trong kết quả PCR lồng cho thấy rằng DNA WSSV đã bị phân hủy thành các mảnh nhỏ hơn và do đó đã mất khả năng lây nhiễm. Ngược lại, kích thước sản phẩm khuếch đại qPCR chỉ là 69-bp, một sản phẩm khuếch đại nhỏ hơn đáng kể so với PCR lồng. Do đó, ngay cả khi DNA WSSV bị phân mảnh khi luộc, các sản phẩm khuếch đại nhỏ vẫn có thể được khuếch đại và kết quả dương tính thu được từ qPCR.

Để xác nhận khả năng lây nhiễm của tôm nhiễm WSSV chỉ cho kết quả dương tính bằng qPCR, một thử nghiệm thách thức thực nghiệm đã được tiến hành với quần thể tôm SPF. Tỷ lệ sống sót cuối cùng cao ở tất cả các bể cho ăn bằng mô tôm băm nhỏ dương tính với qPCR WSSV đã tiếp xúc với nhiệt độ luộc trong khoảng từ 1 đến 30 phút. Tỷ lệ tử vong chỉ xảy ra ở tôm tiếp xúc với mô băm nhỏ dương tính với WSSV (luộc 0 phút). Các tôm sống sót vào cuối thử thách từ tất cả các bể đã được phân tích bằng H&E và qPCR. Các thể thân WSSV trong biểu mô cuticular và mô liên kết được tìm thấy ở tôm đã được cho ăn bằng mô băm nhỏ đối chứng dương tính. Ngược lại, bệnh lý của tôm bị thách thức với mô dương tính WSSV được luộc ở 1, 3, 5, 10 và 30 phút không cho thấy bất kỳ tổn thương mô học nào điển hình của nhiễm WSSV. Hình 3A và 3C cho thấy phần dạ dày mô học của một con tôm tiếp xúc với mô dương tính WSSV đã được luộc trong 1 phút. Phân tích qPCR được thực hiện từ hai nhóm mẫu của mỗi bể. Các kết quả qPCR dương tính chỉ được tìm thấy ở tôm bị thách thức với mô dương tính WSSV (đối chứng dương tính).

Kết quả của nghiên cứu của chúng tôi cho thấy việc nấu tôm có thể giảm sự lây lan của WSSV từ các tuyến đường xuất khẩu / nhập khẩu toàn cầu cho tôm nuôi. Chúng tôi tin rằng điều này sẽ có lợi cho ngành tôm và những người khác để áp dụng phương pháp của chúng tôi để kiểm tra các mầm bệnh vi sinh khác nhiễm tôm nuôi, bao gồm các virus khác cũng như vi khuẩn và nấm.

Các triển vọng

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tôm nhiễm WSSV đã được luộc ở nhiệt độ sôi trong các khoảng thời gian khác nhau, bao gồm 0, 1, 3, 5, 10 và 30 phút. Sau khi tiếp xúc với nhiệt độ sôi, tôm nhiễm WSSV đã được cho ăn cho tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương SPF (L. vannamei). Kết quả cho thấy rằng tôm bị thách thức trong thí nghiệm từ điều trị 0 phút (đối chứng dương tính) thực sự bị nhiễm WSSV. Tuy nhiên, tôm bị thách thức thực nghiệm được cho ăn mô đã nấu trong 1, 3, 5, 10 và 30 phút không bị nhiễm WSSV.

Dữ liệu tỷ lệ tử vong cho thấy chỉ có điều trị đối chứng dương tính (0 phút) thể hiện tỷ lệ tử vong cao, trong khi không phát hiện tỷ lệ tử vong nào ở bất kỳ điều trị nào khác. Những phát hiện này gợi ý rằng việc nấu tôm ở nhiệt độ luộc trong ít nhất 1 phút có thể ngăn ngừa bất kỳ sự lây lan tiềm năng nào của WSSV từ các quốc gia đang lưu hành sang các khu vực địa lý khác nơi WSSV chưa được báo cáo. Một phương pháp lồng để phát hiện WSSV nên được sử dụng thay vì phương pháp qPCR trong khi đánh giá khả năng lây nhiễm của tôm đã nấu chín.

Các tài liệu tham khảo sẽ có từ tác giả tương ứng.