Vi khuẩn vi thể Perezia sp. và bệnh tôm bông.

9 tháng 9 năm 2019

Jee Eun Han, DVM, Ph.D.

Seung Chan Lee

Seul Chan Park

Marc Le Groumellec, DVM, Ph.D.

Phát hiện bằng histopathology, và các phương pháp lai trong và PCR mới

Trong nghiên cứu này, các mẫu tôm nhiễm microsporidia – bao gồm tôm hùm đen (Penaeus monodon) – được thu thập tại Madagascar, Mozambique và Vương quốc Ả Rập Xê-út, với các dấu hiệu lâm sàng của bệnh tôm cotton. Hình ảnh bởi Darryl Jory.

Microsporidia là ký sinh trùng bắt buộc sống trong tế bào của nhiều loại vật chủ, từ động vật không xương sống đến con người. Nghiên cứu về microsporidia đã tập trung nhiều hơn vào các vật chủ trên cạn, nhưng khoảng 50 phần trăm các chi microsporidia đã biết nhiễm các vật chủ thủy sinh như giáp xác và cá. Những nhiễm trùng microsporidian ở vật chủ thủy sinh được coi là một mối nguy hiểm sức khỏe tiềm tàng cũng như rủi ro tài chính trong nuôi thủy sản.

Một trong những bệnh quan trọng ảnh hưởng đến nuôi tôm là “bệnh tôm cotton” (CSD), và các tác nhân gây bệnh liên quan đến bệnh này bao gồm microsporidia được tìm thấy trong ít nhất năm chi, bao gồm Pleistophora, Thelohania, Perezia, Agmasoma và Ameson. Những ký sinh trùng microsporidian này chủ yếu nhiễm vào cơ bắp, làm cho các vùng cơ thể bị ảnh hưởng trở nên trắng hoặc mờ, vì vậy bệnh này được gọi là bệnh tôm cotton. Tôm nhiễm nhẹ có thể trông và hành xử bình thường, nhưng nhiễm nặng khiến tôm không thể tiêu thụ hoặc không thể bán. Ở tôm, vẻ ngoài trắng-mờ của cơ bắp chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng microsporidian. Tuy nhiên, các tác nhân gây bệnh khác như dinoflagellates, vi khuẩn hay virus cũng có thể liên quan đến bệnh này.

Nghiên cứu này tập trung vào microsporidium liên quan đến CSD ở tôm thu thập từ Madagascar, Mozambique và Vương quốc Ả Rập Xê-út. Chúng tôi đã nghiên cứu các đặc điểm histopathological và xác định phân loại thuế của nó thông qua giải trình tự rDNA tiểu đơn vị nhỏ (SSU rDNA). Những chuỗi này được sử dụng rộng rãi để làm rõ mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật, vì chúng có nguồn gốc cổ xưa và có mặt trong tất cả các hình thức sống đã biết.

Các phương pháp chẩn đoán cụ thể cũng đã được phát triển cho bệnh này dựa trên: 1. lai trong (ISH; một loại lai sử dụng DNA, RNA hoặc chuỗi axit nucleic biến đổi có nhãn (tức là, đầu dò) để xác định một chuỗi DNA hoặc RNA cụ thể trong một phần hoặc đoạn mô); và 2. phản ứng chuỗi polymerase (PCR), một phương pháp thường được sử dụng trong sinh học phân tử để tạo ra nhiều bản sao của một đoạn DNA cụ thể) nhằm mục tiêu vào chuỗi SSU rDNA.

Thiết lập nghiên cứu

Tổng cộng có 298 mẫu tôm có dấu hiệu lâm sàng của CSD được gửi từ Madagascar, Mozambique và Ả Rập Xê-út đến Phòng Thí nghiệm Bệnh lý Nuôi trồng Thủy sản tại Đại học Arizona trong một khoảng thời gian hàng năm. Bảng 1 tóm tắt thông tin liên quan.

Bảng 1. Mẫu bệnh tôm cotton được sử dụng trong nghiên cứu này (được chỉnh sửa từ bảng gốc). Các mẫu được phân tích bằng xét nghiệm histopathological (để xác định sự hiện diện của microsporidian) và các xét nghiệm PCR. Hệ thống xếp hạng Gdao động từ G0 (âm tính) đến G4 (mức độ nghiêm trọng cao nhất). Cột PCR chỉ ra cơ quan mục tiêu dương tính với Perezia sp. (HP: gan tụy; LO: cơ quan lympho). PL: ấu trùng; pos.: dương tính; na: không có sẵn.

Các mẫu đã được xử lý bằng AFA (alcohol-formalin-acetic acid), được nhúng vào paraffin và cắt (độ dày 4 µm) theo các phương pháp tiêu chuẩn (Lightner, 1996). Sau khi nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E) hoặc Giemsa, các phần được phân tích bằng kính hiển vi ánh sáng và độ nghiêm trọng của nhiễm trùng được xếp hạng theo hệ thống xếp hạng G đã được thiết lập trước (từ Lightner, 1996). Xếp hạng bao gồm (G0) không có dấu hiệu nhiễm trùng/không nhiễm bởi tác nhân gây bệnh; (G1) có dấu hiệu nhiễm trùng/không nhiễm bởi tác nhân gây bệnh, nhưng ở mức dưới mức cần thiết cho bệnh lâm sàng; (G2−G3) có dấu hiệu nhiễm trùng và/hoặc không nhiễm trung bình đến cao bởi số lượng và mức độ nghiêm trọng của tổn thương do tác nhân gây bệnh; và (G4) tổn thương nghiêm trọng và tiêu hủy mô tiến triển với số lượng tác nhân gây bệnh cao.

Kết quả và thảo luận

Khám nghiệm histopathology

Ở tôm và các giáp xác khác, Perezia spp. phá hủy các vùng cơ và dần dần thay thế cơ bắp bằng các khối phát triển của ký sinh trùng và bào tử. Ở các giai đoạn cuối của nhiễm trùng, ký sinh trùng có thể xâm nhập vào các mô và cơ quan khác – như các tế bào cơ tim, tế bào biểu mô và mô liên kết của tuyến râu – trong cùng một con tôm. Trong nghiên cứu này, nhiều mô của cùng một con tôm đã bị ảnh hưởng bởi microsporidium này. Khám nghiệm histopathology cho thấy nhiều bào tử microsporidian trong các mẫu được thu thập từ Madagascar, Mozambique và Ả Rập Xê-út. Nhiễm trùng chủ yếu ảnh hưởng đến gan tụy và cơ bắp, với mức độ nghiêm trọng tương ứng với hệ thống xếp hạng từ G1 đến G4.

Bào tử trưởng thành được nhìn thấy giữa các sợi cơ (Hình. 1A, B), và các giai đoạn trước bào tử và bào tử nhiễm tế bào biểu mô của ống gan tụy (Hình. 1C, D). Trong nhiễm trùng nặng, bào tử cũng được quan sát bên trong các tế bào biểu mô của sợi mang (Hình.1E, F), các sợi cơ tim (Hình. 1G), và các tế bào cấu trúc của ống lympho (Hình. 1H). Bào tử phát tán khắp cơ thể ở các giai đoạn tiến triển của nhiễm trùng có thể đã phát sinh từ nhiễm trùng cơ: cơ dần dần bị tàn phá và bào tử làm ô nhiễm các mô xung quanh. Ngoài ra, hầu hết các trường hợp (90 phần trăm) của CSD đi kèm với nhiễm trùng bệnh bám mang do Zoothamnium sp. hoặc Epistylis sp., điều này cho thấy rằng động vật mắc microsporidiosis có khả năng yếu và nhạy cảm với nhiễm trùng hoặc nhiễm loài thứ cấp.

Hình. 1:

Những tổn thương tiêu biểu đặc trưng cho bệnh do microsporidian được tìm thấy trong tôm penaeid từ Madagascar, Mozambique và Ả Rập Xê-út. (A,B) Bào tử trưởng thành tích tụ giữa các sợi cơ; (C,D) bào tử trước (mũi tên) và giai đoạn bào tử (mũi tên đầu) bên trong các tế bào biểu mô ống gan tụy (hình trên cho thấy các tế bào bị bong); (E,F) các tích tụ bào tử trưởng thành bên trong tế bào biểu mô sợi mang; (G) bào tử trưởng thành bên trong các sợi cơ tim; (H) các tế bào cấu trúc của ống cơ quan lympho. Nhuộm: (A,C,E,G,H) Mayer-Bennett hematoxylin/eosin-phloxine; (B,D,F) Giemsa. Đường kính = 30 µm.

Chuỗi SSU rDNA của microsporidium mới gây CSD

Chúng tôi đã thực hiện PCR nhằm vào các chuỗi SSU rDNA từ tôm nhiễm CSD, thu thập từ Madagascar, và đã thu được một đoạn dài 1,2 kbp và đã giải trình tự. Chuỗi nucleotide của SSU rDNA đã được nộp vào Genbank. Theo kết quả thử nghiệm, chuỗi nucleotide có độ đồng nhất 94 phần trăm với chuỗi SSU rDNA của Pleistophora sp. nhiễm Penaeus setiferus, và 93 phần trăm độ đồng nhất với một micro sporidium chưa xác định từ Metapenaeus joineri. Năm 2002, Pleistophora sp. từ P. setiferus được xác định lại là Perezia nelsoni qua các khám nghiệm hình thái. Dựa trên thông tin chuỗi, chúng tôi do đó hiện coi microsporidium mới được xác định là thuộc về chi Perezia, và sẽ gọi nó là Perezia sp. từ giờ trở đi. CSD do Perezia sp. gây ra dường như đã lan rộng trên nhiều quốc gia nuôi tôm, bao gồm Madagascar, Mozambique, Ả Rập Xê-út (nghiên cứu hiện tại), Hoa Kỳ và Nhật Bản, nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ.

Trong nghiên cứu này, DNA gen được chiết xuất từ các mẫu Madagascar và Ả Rập Xê-út đã được thực hiện PCR với các mồi đặc hiệu nhằm vào SSU rDNA. Các chuỗi thu được có độ đồng nhất 100 phần trăm cho cả hai mẫu. Tình cờ, virus hội chứng đốm trắng (WSSV) phát hiện tại cùng 3 quốc gia này (Madagascar, Mozambique và Ả Rập Xê-út) cũng cho thấy các mẫu gen giống hệt nhau.

Perezia sp. – ISH đặc hiệu

Đầu dò phản ứng mạnh với cả cơ bắp và gan tụy (Hình. 2A-C), và các cơ quan khác như mang, tim và cơ quan lympho (dữ liệu không được hiển thị), tương ứng với kết quả histopathology. Đầu dò được thiết kế từ chuỗi SSU rDNA của Perezia sp. dường như là đặc hiệu cho tôm có triệu chứng của CSD từ Madagascar, Mozambique và Ả Rập Xê-út.

Ban đầu, chúng tôi đã nhầm lẫn nhiễm Perezia sp. với nhiễm EHP bằng cách kiểm tra histopathology bình thường. Tuy nhiên, đầu dò ISH này không phản ứng với P. stylirostris nhiễm với E. hepatopenaei (Hình. 2D). Không có phản ứng nào được thấy trong bất kỳ mô nào được chuẩn bị từ P. vannamei không có tác nhân gây bệnh. Cũng như vậy, P. vannamei và P. monodon – cũng như polychaetes nhiễm một microsporidium giống Agmasoma chưa xác định – không phản ứng với các đầu dò ISH (dữ liệu không được đưa vào đây).

Hình. 2:

Bài kiểm tra lai trong (ISH) với một đầu dò gen được đánh dấu digoxigen cụ thể cho việc phát hiện microsporidian gây bệnh tôm cotton. Kết tủa màu xanh đậm chỉ ra sự hiện diện của ký sinh trùng (A) bên trong các tế bào biểu mô ống gan tụy của Penaeus indicus từ Ả Rập Xê-út, (B) giữa các sợi cơ của P. monodon từ Mozambique và (C) bên trong các tế bào biểu mô ống gan tụy của P. monodon từ Madagascar. (D) Một phần của gan tụy từ P. stylirostris từ Brunei nhiễm bởi Enterocytozoon hepatopenaei cho thấy kết quả tiêu biểu, nhấn mạnh tính đặc hiệu của đầu dò khi không có kết tủa màu xanh đậm. Nhuộm: Nhuộm đối kháng Bismark-Brown. Đường kính = 30 μm.

Perezia sp. – PCR đặc hiệu

Để mục đích chẩn đoán, chúng tôi đã thiết kế một cặp mồi PCR nhắm vào DNA của Perezia sp. và tạo ra một sản phẩm amplicon dài 443 bp (thuật ngữ sinh học phân tử để chỉ một đoạn DNA hoặc RNA là nguồn và/hoặc sản phẩm của các sự kiện khuếch đại hoặc tái sản xuất), được hiển thị trong Hình. 3. Phản ứng PCR này đặc hiệu cho microsporidium Perezia sp. gây ra CSD, và do đó có thể hữu ích để giám sát ký sinh trùng này. Các mồi này không phản ứng với DNA microsporidian từ tôm nhiễm E. hepatopenaei (dữ liệu không được hiển thị). Cũng không có phản ứng chéo với DNA gen từ tôm (P. vannamei, P. monodon, P. indicus, P. stylirostris và Macrobrachium rosenbergii), polychaetes, mực và Artemia spp. (dữ liệu không được hiển thị).

Chúng tôi không phân tích các mẫu Mozambique bằng PCR, nhưng đầu dò đã phản ứng mạnh mẽ với ISH bằng cách phân bổ các sản phẩm phản ứng trong các tế bào mục tiêu trong các mẫu Mozambique. Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả các microsporidia nhiễm cơ bắp và gan tụy gây ra CSD ở tôm từ Madagascar, Mozambique và Ả Rập Xê-út trong khu vực Biển Đỏ – Ấn Độ Dương.

Hình. 3:

Kết quả PCR đặc hiệu cho Perezia sp. Các làn 1-2: gan tụy của Penaeus monodon từ Madagascar; Các làn 3-6: cơ bắp của P. monodon từ Madagascar; Các làn 7-8: cơ bắp của P. indicus từ Ả Rập Xê-út; Làn 9: Enterocytozoon hepatopenaei (EHP); Làn 10: đối chứng không có tác nhân gây bệnh (SPF); Làn 11: đối chứng âm tính (NC).

Triển vọng

Các nhiễm trùng microsporidian đã được xác nhận thông qua phân tích histopathological và các ký sinh trùng được xác định là Perezia sp. Chúng tôi cũng đã phát triển các xét nghiệm ISH và PCR có khả năng phát hiện ký sinh trùng này. Các phương pháp này có thể hỗ trợ các nhà sản xuất tôm trong chẩn đoán và quản lý CSD do microsporidium Perezia sp. gây ra.

Các tài liệu tham khảo có thể tham khảo từ tác giả đầu tiên.

Bây giờ bạn đã đến cuối bài viết…

… vui lòng xem xét việc hỗ trợ sứ mệnh của GSA để thúc đẩy các thực hành thủy sản có trách nhiệm thông qua giáo dục, vận động và sự đảm bảo của bên thứ ba. The Advocate nhằm mục đích ghi lại sự tiến hóa của các thực hành thủy sản có trách nhiệm và chia sẻ kiến thức phong phú từ mạng lưới đóng góp rộng lớn của chúng tôi.

Bằng cách trở thành một thành viên của Global Seafood Alliance, bạn đang đảm bảo rằng tất cả các công việc trước cạnh mà chúng tôi thực hiện thông qua những lợi ích, tài nguyên và sự kiện dành cho thành viên có thể tiếp tục. Chi phí thành viên cá nhân chỉ 50 đô la mỗi năm.

Chưa phải là thành viên GSA? Tham gia với chúng tôi.

Hỗ trợ GSA và trở thành một thành viên

Nguồn : https://www.globalseafood.org/advocate/the-microsporidium-perezia-sp-and-cotton-shrimp-disease/