Kết quả thử nghiệm cho thấy tiềm năng cải thiện sự phát triển, sức khỏe
Với sự gia tăng cường độ của các hệ thống nuôi trồng, các đợt bùng phát bệnh tôm ngày càng phổ biến. Trong những năm gần đây, nuôi tôm đã chịu những tổn thất kinh tế nghiêm trọng do sự xuất hiện của một bệnh do vi khuẩn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND), căn bệnh này đã gây ra và vẫn đang gây ra tỷ lệ tử vong ở tôm từ 40 đến 100 phần trăm trong 35–45 ngày đầu tiên sau khi thả postlarvae tôm vào ao nuôi. Là một bệnh truyền nhiễm lan rộng giữa các quốc gia và các châu lục, AHPND là một đại dịch vi khuẩn trong ngành nuôi tôm.
Các nghiên cứu đã tiết lộ rằng vi khuẩn Vibrio gây ra AHPND hiện đã có kháng thuốc đối với một loạt kháng sinh. Với những xu hướng quy định toàn cầu đang thay đổi về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi động vật, rất cần tìm các biện pháp thay thế cho việc sử dụng kháng sinh dự phòng và điều trị trong thức ăn nuôi tôm. Nhiều phụ gia thức ăn với các cơ chế tác động khác nhau nhắm trực tiếp hoặc gián tiếp vào vi khuẩn Vibrio và/hoặc chủ tôm đang được đề xuất. Một ý tưởng đột phá trong việc giảm thiểu nhiễm AHPND sẽ là liên kết trực tiếp các độc tố AHPND, giúp loại bỏ độc tố khỏi cơ thể thông qua bài tiết phân trước khi chúng có thể di chuyển đến gan tụy để gây ra tổn thương.
Đất sét khoáng (ví dụ: montmorillonite) thường được sử dụng làm chất hấp phụ để giảm thiểu tác động của các mycotoxin thức ăn từ thức ăn chăn nuôi. Một công ty Hoa Kỳ (Amlan International Inc.), thông qua các cộng tác viên nghiên cứu của mình, đã phát hiện rằng sản phẩm calcium montmorillonite thương mại hiện có của họ (Calibrin®-Z, có sẵn ở một số thị trường quốc tế) có khả năng liên kết các độc tố PirAB của AHPND in vitro. Do đó, chúng tôi đã quyết định thực hiện một thử nghiệm cho ăn để đánh giá hiệu quả và hiệu suất của Calibrin-Z (CL) trong việc giảm thiểu AHPND.
Montmorillonite thuộc nhóm đất sét smectite và về cơ bản là một aluminosilicate canxi và/hoặc natri hydrat hóa. Một nguồn quan trọng của montmorillonite trong tự nhiên là đá bentonite. Các thành phần chính của montmorillonite được sử dụng trong nghiên cứu này được cho là ít nhất 70 phần trăm montmorillonite và 15 phần trăm silicon dioxide hydrat vô định hình. Nó đã được chọn cụ thể vì khả năng liên kết độc tố và được xử lý bằng một quy trình nhiệt độc quyền để kích hoạt khả năng liên kết độc tố phổ rộng. Đã được chỉ ra rằng nó có khả năng liên kết các độc tố vi khuẩn và nấm in vitro và giảm thiểu tác động của chúng ở gia cầm và gia súc.
Gần đây, chúng tôi đã thực hiện một nghiên cứu để đánh giá xem việc bổ sung CL vào thức ăn có mang lại lợi ích nào cho hiệu suất phát triển, hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng kháng bệnh của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Penaeus vannamei) đối với AHPND hay không. Theo như chúng tôi biết, đây là báo cáo đầu tiên về tác động của montmorillonite trong thức ăn đến vi sinh vật trong dạ dày tôm trong quá trình nhiễm AHPND. Xét đến quy mô của đại dịch AHPND và mối quan tâm lớn từ các nhà nuôi tôm trong việc tìm kiếm giải pháp tiết kiệm chi phí, việc điều tra các biện pháp thay thế cho kháng sinh là rất cần thiết và quan trọng.
Thử nghiệm cho ăn và thách thức bệnh tật
Bốn chế độ ăn thực tiễn đã được sản xuất bằng cách sử dụng một loại thức ăn cho tôm post-larval thương mại (Post Larva II crumbles #902, Gold Coin Specialities Ltd., Malaysia) làm cơ sở. Thức ăn tôm thương mại được nghiền thành bột mịn trước khi được ép viên lại. Chế độ ăn đối chứng dương tính (posCON) và đối chứng âm tính (negCON) bao gồm thức ăn tôm thương mại được ép viên lại với sự bổ sung của một chất kết dính viên (Pegabind®, Bentoli AgriNutrition Co., Ltd., Thái Lan). Chỉ có tôm được cho ăn chế độ ăn posCON mới bị thách thức với Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND). Hai chế độ ăn khác với sự bổ sung 0,25 phần trăm (0,25 phần trăm CL) hoặc 0,5 phần trăm (0,5 phần trăm CL) đất sét montmorillonite (Calibrin®-Z) tính vào α-cellulose cũng đã được ép viên. Các chế độ ăn đối chứng không có đất sét bổ sung.
Tại thời điểm bắt đầu thử nghiệm cho ăn, tất cả tôm SPF (PL30) đã bị nhịn đói qua đêm, và các nhóm 20 con tôm khỏe mạnh rõ ràng đã được cân, chuyển đến mỗi bể 15 lít và được phân bổ ngẫu nhiên vào một trong các chế độ ăn thử nghiệm. Các nhóm tôm lặp lại được cho ăn bằng tay với chế độ ăn tương ứng ba lần mỗi ngày vào lúc 9 giờ sáng, 2 giờ chiều và 6 giờ chiều cho đến no trong hai tuần. Tất cả tôm được đếm và cân theo từng đợt vào cuối thử nghiệm cho ăn. Trong suốt thời gian thử nghiệm cho ăn, độ mặn, oxy hòa tan, pH và nhiệt độ của nước nuôi đều trong phạm vi 23 ± 1‰, 5,5 ± 0,1 mg/L, 8,1 ± 0,2, 28 ± 0,4 độ C.
Sau khi hoàn thành thử nghiệm tăng trưởng, một mẫu phụ với số lượng tôm cần thiết từ mỗi chế độ ăn thử nghiệm được ngẫu nhiên loại bỏ từ mỗi bể, thu gom lại và sau đó được tái thả ở mức 16 tôm mỗi bể cho thử nghiệm thách thức bệnh. Thử nghiệm thách thức bệnh được thực hiện bằng phương pháp ngâm. Tôm từ mỗi bể trong nhóm posCON, 2.5 phần trăm CL hoặc 5 phần trăm CL đã được đặt trong 15 phút (kèm theo thông khí) trong một bình Erlenmeyer 1 lít chứa 150 mL dung dịch VPAHPND (108 CFU/mL). Sau đó, dung dịch vi khuẩn bao gồm tôm được đổ trực tiếp trở lại bể tương ứng của chúng chứa nước biển nhân tạo sạch để đạt được mật độ vi khuẩn khoảng 106 CFU/mL. Điều trị đối chứng âm tính (negCON) được bao gồm để phục vụ như một kiểm soát môi trường và tôm không bị thách thức với VPAHPND mà được ngâm trong nước dinh dưỡng tryptic soy broth vô trùng cộng với 1,5 phần trăm NaCl. Trong suốt thời gian thử nghiệm thách thức bệnh kéo dài bảy ngày, tôm được cho ăn hai lần mỗi ngày bằng chế độ ăn tương ứng và nhận được 50 phần trăm lượng nước đổi mới vào buổi sáng. Tất cả tôm được quan sát mỗi ba giờ để theo dõi các dấu hiệu lâm sàng rõ ràng và tỷ lệ tử vong. Tôm chết được ghi lại và loại bỏ khỏi các bể thí nghiệm.
Sau thử nghiệm thách thức AHPND, gan tụy đã được cắt bỏ một cách vô trùng để phân tích vi sinh vật học và sinh lý học. Dạ dày tôm cũng được lấy ra để phân tích vi sinh vật. Tất cả dữ liệu thu thập được sau đó đã được phân tích thống kê. Chi tiết toàn diện về các phương pháp được sử dụng có thể được tìm thấy trong ấn phẩm gốc của Ng et al. (2023), Đất sét montmorillonite đã cải thiện khả năng sống sót của Penaeus vannamei khỏi bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và điều chế vi sinh vật dạ dày. Animal Feed Science and Technology 297, 115581.
Hiệu quả của đất sét montmorillonite (Calibrin®-Z)
Tất cả các chế độ ăn thí nghiệm đều được tôm tiếp nhận tốt và vào cuối thử nghiệm cho ăn, tôm đã tăng gấp đôi trọng lượng cơ thể ban đầu. Việc bổ sung CL vào chế độ ăn không ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển, hiệu quả sử dụng thức ăn, lượng thức ăn và tỷ lệ sống sót của tôm, và tất cả các tham số này không có sự khác biệt đáng kể (P > 0.05). Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) rất tốt với các giá trị gần 1.0 và tỷ lệ sống sót của tôm đạt 95 phần trăm hoặc cao hơn ở tất cả các nhóm điều trị.
Tôm trong nhóm negCON (không bị thách thức với VPAHPND) cho thấy tỷ lệ sống sót trung bình là 95,8 ± 2,1 phần trăm trong suốt bảy ngày thử nghiệm thách thức bệnh. Chỉ có hai trường hợp tử vong trong tổng số 48 tôm trong nhóm negCON. Tôm trong nhóm posCON bị thách thức bằng VPAHPND có tỷ lệ sống sót trung bình thấp nhất là 39,6 ± 10,4 phần trăm, thấp hơn đáng kể (P < 0,05) so với nhóm đối chứng âm tính. Tôm bị nhiễm cho thấy các triệu chứng lâm sàng điển hình của AHPND. Tỷ lệ sống sót của tôm được cho ăn chế độ dinh dưỡng CL, bất kể mức độ chế độ ăn, không có sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng âm tính không bị thách thức. Không có sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ sống sót của tôm được cho ăn 0,25 phần trăm hoặc 0,5 phần trăm CL trong suốt thử nghiệm thách thức bệnh.
Vi sinh vật dạ dày
Chỉ số Simpson của biểu đồ đa dạng alpha đo lường sự phong phú (số lượng biến thể chuỗi amplicon, ASV) và sự đều đặn của ASV cấu thành sự phong phú của mẫu. Một chỉ số Simpson cao cho thấy số lượng ASV cao và tỷ lệ ASV có tỷ lệ tương đồng nhiều hơn. Khi bị thách thức với VPAHPND, sự đa dạng vi khuẩn trong nhóm posCON bị giảm so với tôm khỏe mạnh không bị thách thức trong nhóm negCON. Việc bổ sung chế độ ăn cho tôm với 0,25 phần trăm CL có xu hướng phục hồi sự phong phú và chỉ số đa dạng của vi khuẩn trong dạ dày tốt hơn nhiều so với nhóm 0,5 phần trăm CL.
Ở cấp độ ngành, cấu trúc cộng đồng vi khuẩn trong dạ dày tôm chủ yếu gồm Proteobacteria và Bacteroidetes với Verrucomicrobia đứng thứ ba trong độ phong phú tương đối. Sự phong phú tích lũy của ba ngành này cao hơn 90 phần trăm trong các nhóm điều trị. Nhóm posCON có sự phong phú tương đối tăng lên của Proteobacteria và giảm sự phong phú tương đối của Tenericutes so với nhóm negCON. Sự phong phú tương đối của Verrucomicrobia và Actinobacteria được quan sát thấy trong dạ dày của tôm được cho ăn chế độ ăn bổ sung CL. Ở nhóm điều trị 0,5 phần trăm CL, sự phong phú của Firmicutes có phần nổi bật hơn so với các nhóm điều trị khác.
Tiềm năng của đất sét montmorillonite
Việc sử dụng montmorillonite như một thành phần trong thức ăn chăn nuôi đã báo cáo các kết quả có lợi. Rất ít thông tin hiện có về tác động của montmorillonite trong chế độ ăn đối với hiệu suất phát triển của động vật thủy sinh. Ngoài những khác biệt đặc thù giữa các loài, sự khác biệt giữa các nghiên cứu được công bố về tác động của montmorillonite đối với hiệu suất phát triển của động vật thủy sinh rất có thể là do nguồn gốc và loại montmorillonite được sử dụng. Độ tinh khiết, thành phần hóa học và các đặc tính chức năng của montmorillonite tự nhiên rất phụ thuộc vào nơi mà khoáng đất sét được khai thác. Calibrin®-Z là duy nhất ở vị trí khai thác và quy trình của nó, vì vậy có thể không khả thi để quy kết các tác động tích cực của nó như đã quan sát thấy trong nghiên cứu hiện tại cho tất cả các montmorillonite.
Kết quả của thử nghiệm tăng trưởng mà chúng tôi đã thực hiện cho thấy việc bổ sung CL vào thức ăn của tôm trắng không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất phát triển. Sự bổ sung montmorillonite dưới dạng sản phẩm thương mại CL lên đến 0,5 phần trăm của chế độ ăn không gây ra bất kỳ độc tính hay vấn đề về độ hấp dẫn của thức ăn như đã thấy ở tỷ lệ sống sót cao của tôm và lượng thức ăn và FCR rất tốt.
Khi bị thách thức với VPAHPND, tỷ lệ sống sót của tôm được cho ăn 0,25 phần trăm hoặc 0,5 phần trăm CL rất cao (83 đến 94 phần trăm) và không có sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng âm tính không bị thách thức. Kết quả này cho thấy rằng montmorillonite trong chế độ ăn có khả năng bảo vệ tôm khỏi tỷ lệ tử vong do các độc tố vi khuẩn được phát hành bởi VPAHPND.
Chúng tôi tin rằng cơ chế chính của montmorillonite trong việc giảm thiểu AHPND là thông qua sự hấp phụ của các độc tố PirAB đôi của AHPND vào bề mặt và các lớp liên kết của nó. Các độc tố vi khuẩn có thể di chuyển qua các lỗ thông liên kết và các kênh mao mạch hướng tới các vị trí liên kết bên trong. Nhiều vị trí mang điện tích dương trong cấu trúc montmorillonite, chẳng hạn như các cation ở giữa lớp và các cạnh của các đơn vị octahedral, cung cấp các vị trí hấp phụ. Các hạt opal tự nhiên giúp duy trì cấu trúc lớp của CL và góp phần vào khả năng liên kết cao.
Các lực hấp phụ trên bề mặt đất sét bao gồm tương tác kỵ nước, chelat hóa, liên kết hydro, lực tĩnh điện và lực van der Waals. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi tin rằng các độc tố vi khuẩn bị hấp phụ bởi montmorillonite đã bị loại bỏ khỏi khả năng hấp thụ trong ruột tôm và cuối cùng bị thải ra khỏi cơ thể qua việc tiết phân. Hơn nữa, việc kiểm tra bệnh lý mô học của gan tụy, mục tiêu chính của các độc tố PirAB, xác nhận rằng tôm được cho ăn chế độ ăn có bổ sung montmorillonite cho thấy rất ít tổn thương so với tôm bị thách thức AHPND được cho ăn chế độ ăn đối chứng không có bổ sung montmorillonite nào. Điều này cho thấy rằng rất ít hoặc không có độc tố PirAB đã di chuyển đến gan tụy để gây tổn thương mô, khi các độc tố bị hấp phụ bởi MMT có khả năng được di chuyển dọc theo ruột ra xa gan tụy do nhu động và cuối cùng được thải ra qua phân.
Nghiên cứu hiện tại là báo cáo đầu tiên về sự điều chỉnh của vi sinh vật dạ dày tôm bởi montmorillonite trong chế độ ăn trong quá trình nhiễm bệnh. Việc bổ sung montmorillonite vào chế độ ăn của tôm trắng đã được quan sát thấy làm tăng sự đa dạng vi sinh vật, đặc biệt là ở nhóm 0,25 phần trăm CL. Sự đa dạng vi khuẩn trong dạ dày của tôm bị nhiễm AHPND đã giảm rõ rệt so với tôm khỏe mạnh. Hiện tại có rất ít thông tin về sự thay đổi của vi sinh vật dạ dày để phản ứng với AHPND, nhưng nhìn chung được biết rằng sự đa dạng vi khuẩn trong ruột cao hơn phản ánh sức khỏe ruột tốt hơn và sức khỏe động vật sau đó.
Ở cấp độ ngành, chúng tôi đã xác định Proteobacteria và Bacteroidetes là các nhóm chính. Chúng tôi quan sát thấy rằng dưới tình trạng nhiễm AHPND, sự phong phú tương đối của Proteobacteria đã tăng lên so với tôm không bị thách thức. Chúng tôi xác định rằng vi khuẩn thuộc chi Pseudoalteromonas, Tenacibaculum và Marinimicrobium là các thành viên của hệ vi sinh vật khỏe mạnh và Lysobacter tương đối phong phú hơn trong dạ dày của tôm bị nhiễm AHPND. Vai trò thực tế của những thay đổi trong cộng đồng vi khuẩn này vẫn cần được làm sáng tỏ.
Tôm được cho ăn 0,25 phần trăm CL cho thấy sự phong phú tương đối cao nhất của Verrucomicrobia và Actinobacteria, tiếp theo là nhóm 0,5 phần trăm CL. Sự phong phú tương đối của Firmicutes phổ biến hơn trong nhóm 0,5 phần trăm CL so với các nhóm điều trị khác. Một mô tả đầy đủ về kết quả của vi sinh vật dạ dày có thể được lấy từ ấn phẩm gốc. Ngoài khả năng của montmorillonite trong việc liên kết độc tố PirAB và giảm thiểu rối loạn sinh lý dạ dày do AHPND, khả năng của montmorillonite trong việc điều chỉnh vi sinh vật dạ dày cũng có thể là do khả năng của montmorillonite trong việc hấp phụ và cố định vi khuẩn một cách chọn lọc trên bề mặt và lớp liên kết của nó, tạo ra các hồ sơ vi khuẩn khác nhau được quan sát trong nghiên cứu này.
Các triển vọng
Trong kết luận, montmorillonite trong chế độ ăn có thể được sử dụng như một biện pháp thay thế cho kháng sinh nhằm giảm thiểu và ngăn ngừa đại dịch AHPND trong nuôi tôm. Nó cung cấp một giải pháp tự nhiên cho một vấn đề quan trọng hiện tại trong tính bền vững của ngành nuôi tôm. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã cố ý sử dụng kích thước tôm được biết là dễ bị tổn thương nhất đối với AHPND trong chu kỳ sản xuất. Dựa trên các kết quả trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đề xuất rằng CL ở mức tối thiểu 0,25 phần trăm nên được bổ sung vào thức ăn tôm thương mại như một “chính sách bảo hiểm” và biện pháp phòng ngừa chống lại sản xuất và thiệt hại kinh tế từ các đợt bùng phát AHPND tiềm năng trong các trang trại tôm. Nên có thêm các nghiên cứu dài hạn và thực địa để hoàn toàn làm rõ tác động có lợi của montmorillonite trong thức ăn của động vật thủy sản nuôi.
Các tài liệu tham khảo có sẵn từ tác giả.
